核酸提取仪

核酸提取仪
关键词：核酸提取、核酸提取仪、纳米生物磁珠、核酸提取试剂盒
洛阳惠尔纳米科技有限公司
狄光辉
QQ：625006192
目录
第1章核酸提取技术 (4)
1.1 核酸提取技术的发展 (4)
1.2 核酸提取方法 (6)
1.2.1 CTAB法 (6)
1.2.2 离心柱子法（质粒为例） (7)
1.2.3 碱裂解法（质粒为例） (8)
1.2.4 胍盐裂解法（植物为例） (10)
1.2.5 酚抽提法（全血为例） (12)
1.2.6 Trizol法（动物组织为例） (13)
1.2.7 磁珠法（植物为例） (16)
1.3 核酸提取下游实验 (17)
1.3.1 PCR (17)
1.3.2 转基因 (18)
1.3.3 构建基因文库 (18)
1.3.4 分子测序 (18)
1.3.5 分子诊断 (19)
1.3.6 亲子鉴定 (19)
1.3.7 法医鉴定 (19)
1.3.8 基因敲除 (20)
1.3.9 基因芯片 (20)
1.3.10 动植物资源保存鉴定 (20)
第2章核酸提取仪 (21)
2.1 核酸提取仪的应用领域 (21)
2.1.1 基因组学 (21)
2.1.2 CDC (21)
2.1.3 临床样品的分子诊断 (21)
2.1.4 畜牧兽医 (21)
2.1.5 法医学的应用 (22)
2.2 核酸提取仪的结构 (22)
2.2.1 磁棒式提取仪 (22)
2.2.2 工作站提取仪 (24)
2.3 核酸提取的步骤 (26)
2.4 国外核酸提取仪的巨头公司 (26)
2.4.1 美国贝克曼库尔特有限公司 (27)
2.4.2 雅培 (27)
2.4.3 罗氏 (27)
2.4.4 QIAGEN (27)
2.4.5 Thermo (28)
2.4.6 贝克曼 (28)
2.4.7 ABI (29)
2.4.8 Promega (31)
第3章国内核酸提取仪厂家及型号介绍 (33)
3.1 台灣圓點奈米技術股份有限公司 (33)
3.2 洛阳惠尔纳米科技有限公司 (33)
3.3 西安天隆科技有限公司 (36)
3.4 北京百泰克生物技术有限公司 (38)
3.5 厦门致善生物科技有限公司 (39)
3.6 杭州博日科技有限公司 (41)
3.7 厦门欧达科仪有限公司 (42)
3.8 科华生物 (43)
3.9 瑞基海洋生物科技股份有限公司 (44)
第4章核酸提取仪发展方向 (47)
4.1 便捷化 (47)
4.2 自动化 (47)
4.3 高通量 (47)
4.4 一体化 (47)
4.5 人性化 (47)
作者简介 (48)
第1章核酸提取技术
随着近年来分子生物学技术的高速发展，以核酸扩展，核酸杂交，DNA序列测序分析等分子检测和分子诊断技术在人体健康体检、食品、药品、法医、兽医等领域中日益显得至关重要的作用。

新型的分子生物学检测技术主要包括聚合酶链反应、微芯片、高通量测序等。

然而，所有现代分子生物学检测技术首先面临的问题就是如何从复杂多样的植物样本中迅速有效的分离提取所需的基因组核酸，并且抽提后的核酸质量及完整性都会直接影响到下游的实验结果。

1.1核酸提取技术的发展
1869年人类首次发现核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，核酸的提取的技术和方法就随着进行发展进步。

其中包括对核酸提取的各种材料和试剂进行了改进，十二烷基磺酸钠、酚、脲、盐酸胍等各种各样的化学试剂被纷纷应用到核酸提取实验中。

1948年，Chargaff等人使用柠檬酸钠和RNase获得了具有天然性状的DNA。

1957年Kirby运用酚抽提DNA，即向细胞裂解液中加人等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：l体积)混合液，离心后收集上层水相并以异丙醇沉淀其中的核酸，经乙醇漂洗掉盐分后，使用TE等缓冲液或蒸馏水溶解制备DNA。

1961年Marmur创建了十二烷基磺酸钠(SDS)法，最早用于提取细菌质粒DNA。

该法的原理是基于共价闭合环状DNA保持双链的同时对高相对分子质量的细菌染色体DNA进行选择性的碱变性，使之与细菌蛋白以及破碎的细胞壁形成表面覆盖有十二烷基磺酸盐的复合物，离心后变性物质被去除，质粒DNA便可从上清中回收。

1979年Chirgwin对前人的研究进行了系统地总结，创立了硫氰酸胍法提取RNAHl，异硫氰酸胍是一种强的蛋白变性剂，既可以破裂细胞，也可以抑制核酸酶的作用，但该方法的操作较为繁琐。

1987年Chomczynski和Sacchi在此基础上开创了一步法提取RNA，提高了RNA提取的速度并因此得到了广泛的应用。

1995年Karrwer等人建立了微量移液体法提取DNA。

2002年Asano等人利用激光微解剖法提取到水稻的基因组核酸哺。

2003年Bimbaun等人使用原生质体分离法提取到了拟南芥根系的核酸。

除了上述几种核酸提取方法外，还有其他别的核酸提取方法也得到了实验证实和发展。

核酸的常规提取方法还包括CTAB法、Trizol法、氯化锂法、蜗牛酶法、石英砂法、氯化苄法、反复冻融法、溶壁酶法等。

生物试剂公司已经以这些传统的核酸提取方法为基础研发出了各种各样的核酸提取试剂盒，用于从各种各样不同的组织样本中分离和提取DNA以及RNA，然而，传统的核酸提取技术中所包含的沉淀和离心等操作需要用到大量的生物样本，而且传统提取技术步骤较为繁杂，费时长，收率低，很难实现自动化操作，大部分方法还需要操作人员直接接触有毒的化学试剂，因此，随着分子生物学以及高分子材料学的快速发展，传统的从液相系统中分离提取核酸的方式逐渐被以固相吸附物载体为基础的新方法所取代。

新兴的核酸分离提取方法主要包括：旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法、纳米磁珠提取法等。

不管是采用具体的哪种方法来分离和提取核酸，总的来说，这类方法的操作步骤主要可以分为三步：第一部分是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。

第二部分是把释放的核酸特异地吸附在特定的载体上，并且这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，而对其他的生化组分如蛋白质、多糖、脂类不能具有亲和力和吸附力。

第三部分是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。

离心柱法提取核酸曾经应用得很普及，市场上的多数质粒DNA提取试剂盒都是在离心柱法的基础上发展而来的。

该方法采用特殊的硅基质吸附材料，特点是：高盐酸性缓冲液存在时可特异性吸附DNA，除去RNA与蛋白质等不能结合的杂质，而低盐碱性缓冲液可洗脱结合在吸附柱上的DNA，然而这种方法的缺点是样本需求量大，耗费样品较多，对于某些珍稀样本其应用受到很大的局限，同时离心柱法提取核酸需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，特别是在基因诊断、突发疫情的监测和控制等领域，使用离心柱法提取核酸需要大量的操作人员及仪器设备才能满足需求。

20世纪90年代起，为了适应现代分子生物学检测实验高通量、高灵敏度、自动化操作的需要，运用磁珠提取核酸的方法应运而生了，该方法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他核酸提取方法无法比拟的优势，主要体现在：能够实现高通量操作和自动化，目前已有96孔的核酸自动提取仪，用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理，效率直接提高96倍，符合生物学高通量的操作要求，使得传染性疾病暴发时能得到快速及时有效的应对；操作简单、用
时短，整个提取流程只有四步，基本上可以在30—40 min完成；安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒溶剂，对实验操作人员的伤害少，符合现代以人为本，安全至上的理念；磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大；磁珠提取核酸的方法采用智能化软件操作系统，既能控制孔间污染又能避免批次间的污染；同时保证实验结果的稳定性和重复性，避免人工操作引起的差异及错误；成本低廉，便于广泛应用。

由于磁珠合成采用的都是低价无机和有机原料，无须特殊的仪器设备，使得最终的合成和研发成本都很低，符合我国的基本国情和经济现状，便于广泛应用。

1.2核酸提取方法
1.2.1CTAB法
实验原理
CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

采用机械破碎植物细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA 溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。

主要试剂
2×CTAB提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 2%(w/v)CTAB，40mmol/L 巯基乙醇(随用随加)
TE 缓冲液10mmol/L Tris-HCL （pH7.4），1mmol/L EDTA
氯仿-异戊醇（24 ：1）、70% 乙醇、液氮
主要设备
冷冻高速离心机台式高速离心机、移液器、水浴锅、陶瓷研钵、离心管：50ml，有盖、离心管5ml和1.5ml、小玻棒：形状为弯成钩状的
实验步骤
1. 取1-50g新鲜植物材料，于液氮中研成粉。

2. 将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积(w/v) 2×CTAB提取缓冲液，65℃保温10-20分钟，其间不时摇动。

3. 加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min 离心10-20分钟。

4. 将上清液转入另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min 离心10分钟。

5. 将上层水相转入新的经硅烷化处理的离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇,混匀，室温下放置30分钟。

6. 3500-4000r/min 离心5-10分钟，去上清液, 70%乙醇漂洗，沉淀吹干。

7. 风干后加入40ul的TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。

8. 取2ul溶液电泳检测。

注意事项
所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

1.2.2离心柱子法（质粒为例）
实验原理
试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理（在高盐、低pH值情况下吸附DNA；低盐、高pH值情况下释放DNA.离心柱上含有Resin合成树脂,具有吸附DNA的功能），配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。

实验材料：
含质粒的大肠杆菌DH5α；LB+Amp培养基（配方参照《分子克隆》，除非特别说明，以下同）；柱离心质粒小量制备试剂盒（博大泰克公司）；质粒DNA （pUC18-G）；电泳用琼脂糖；TAE缓冲液；goldview荧光染料；6× DNA上样buffer；限制性内切酶EcoRI （10 U/μl，G’AATTC）；HindIII （10 U/μl，A’AGCTT）；10× buffer R。

实验方法：
1．将带有质粒的大肠杆菌单克隆接种到1.5 ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃振荡培养12～16小时；
2．1.5 ml过夜菌转移至Eppendorf管中，10000 rpm( r/min)离心1 min，用水泵吸干培养基上清液，加入100 l 溶液I(含RNaseA)，充分混匀；
3．加入150 l 溶液II，加盖颠倒6-7次使之混匀，室温放置1～2min；
4．加入150 l 溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，室温放置5min；
5．用台式高速离心机，12000 rpm离心10min；
6．吸附柱中加入420 μl 结合缓冲液，将步骤5中的上清转移至吸附柱中，盖上收集管的盖子，混匀，12000 rpm离心1 min；
7．取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600 μl 漂洗液, 静置1 min，12000 rpm离心30 s；
8．重复步骤7一次；
9．取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，12000 rpm离心2 min；
10．吸附柱放入一个新的1.5 ml离心管，在吸附柱的中央加50 μl洗脱缓冲液或TE buffer或水，室温放置3 ~ 5分钟。

盖好盖子12000 rpm 离心1分钟，收集质粒DNA溶液，-20℃冻存备用；
11．在250 ml椎形瓶中称取0.6 g琼脂糖，加60 ml 1× TAE buffer，在微波炉中加热至沸腾且均匀；
12．往胶溶液中加3 μl goldview荧光染料，混匀，室温自然冷却；
13．制胶板两头分别用胶布封好，放置在水平的实验台上，将梳齿架在制胶板的梳齿槽内，待胶溶液冷至～50℃时，把60 ml胶液全部到入制胶板中，室温自然冷却至充分凝固；
14．撕去封制胶板的胶布，将装有凝胶和梳齿的制胶板放入电泳槽中，加1× TAE 至高过凝胶表面加样孔顶端～2 mm，小心拔出梳齿；
15．取5 μl质粒DNA，与1 μl 6× DNA上样buffer混匀后全部加入点样孔，100 V恒压电泳至溴酚蓝指示剂前沿走到凝胶中间（约需1小时）；
16．关闭电泳仪，连制胶板一起取出凝胶，在凝胶成像系统中观察电泳结果并拍照；
1.2.3碱裂解法（质粒为例）
实验原理
SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤
剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。

实验步骤
1）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

溶液I：50mmol/L葡萄糖。

25mmol/L Tris.Cl(PH=8.0)。

10mmol/LEDTA(pH=8.0)。

溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。

2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）。

1%SDS。

盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。

应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。

不要振荡，将离心管放置于冰上。

3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ。

溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60ml 冰乙酸11.5ml 水28.5ml。

所配成的溶液对钾是3mol/L，乙酸根是5mol/L。

盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。

4）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。

5）可做可不做：加等量酚：氯仿：异戊醇（24:23:1），振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。

有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。

6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。

振荡混合，于室温放置2分钟。

7）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。

8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。

再将附于管壁的液滴除尽。

除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。

当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

9）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，
在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。

i.此法制备的高拷贝数质粒（如Xf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3-5μg。

ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl 水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。

将剩余的DNA贮存于-20℃。

iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物。

1.2.4胍盐裂解法（植物为例）
实验原理
在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取缓冲液中裂解植物组织粉末。

在提取缓冲液中包含RNase酶抑制剂，抑制RNase活性并确保RNA的完整性。

通过第一次离心柱时细胞碎片阻留在柱上，溶液被均质化，包括RNA在内的小分子物质通过离心柱，加入乙醇后，再经过第二个离心柱，RNA就结合在底部有硅胶的膜上，洗去其他杂质，最后用无RNase水溶出RNA，该柱子最大可结合100 μg大于200 bp的RNA，小分子RNA如5.8S、5S、tRNA将会丢失。

每个柱子所用起始材料最多为100 mg，可分离30~70 μg的总RNA。

由于不同发育阶段和不同组织所含RNA不同，可以调整起始材料用量，如果组织含有RNA较少，可用100 mg，若RNA含量较高，则起始材料应小于100 mg。

即使总RNA含量未达到柱子吸附最大值，起始材料太多时，由于裂解不彻底，同样导致RNA产量和纯度降低。

如果总RNA含量超过100 μg，柱子也只能回收100 μg以下的RNA。

对于胚乳等一类组织，则应用RLC提取液，其流程如下：植物组织（＜100 mg）→研磨，提取缓冲液RLC裂解→离心过柱（淡紫色柱）→加入乙醇→离心过柱（粉红色柱），RNA结合在膜上→用缓冲液RW1、RPE洗涤3次→用无RNase水溶出RNA→总RNA。

提取出总RNA后，要对其质量和浓度进行测定。

组成RNA碱基在紫外光谱区都有一定的吸收值，最大吸收波长为250~270 nm。

碱基与磷酸或糖形成核苷酸后，其最大吸收波长为260 nm，吸收波谷为230 nm，这就是分光光度计测定其浓度的原理。

因此根据RNA溶液在260 nm下的OD值就可计算出样品浓度，1 OD值相当于40 μg/ml，其计算分式是：RNA样品浓度（μg/ml）= OD260×40×稀释倍数。

由于蛋白质在280 nm下有吸收高峰，用OD260/ OD280比值就可计算出样品纯度。

分光光度计可测定其浓度和纯度，但不能得到完整性的信息，因此要用琼脂糖凝胶电泳来检查其是否完整。

如前所述，总RNA中含有28S、
18S、5S等rRNA，其中28S、18S最丰富，所占比例基本不变，在琼脂糖凝胶电泳上28S rRNA亮度约为18S rRNA亮度的1倍，这样的结果说明完整性较好。

如果亮度相同，说明已有不同程度的降解。

严重降解的样品，就见不到28S rRNA 的带，甚至18S的带也见不到，呈现一片红。

mRNA在琼脂糖胶上按相对分子质量由大到小连续分布，无明显条带出现。

RNA电泳可在变性和非变性胶上进行，胶的浓度应为1.0~1.5%，在非变性胶上无法判断RNA的相对分子质量，因为RNA迁移率与相对分子质量相关性比较差。

实验步骤
1、称取新鲜叶组织样品100 mg，液氮速冻。

2、在预冷的研钵中研磨成细粉，转移到2 ml离心管中。

注意研磨不彻底则会造成严重产量降低。

3、待液氮挥发（但不能解冻）后，加入450 ml提取缓冲液RLT，涡旋混匀，并在56℃温育1~3 min。

注意：最好在RLT临用前加入1/100体积的14.5 M β-巯基乙醇，加后保存时间不超过1个月，RLT溶液应在1个月内使用。

对于高淀粉含量的材料，可将温度提高到60℃以上防止淀粉结块。

4、将裂解液加到离心柱（淡紫色柱）上，下接一个2 ml收集管，最大转速（10000 g）离心2 min。

如果将裂解液粘稠，可切去吸头顶端，用大口吸头吸取。

裂解液通过柱子时被均质化，大部分组织碎片都被截留在柱子表面，只有少部分通过柱子形成沉淀，因此，应小心吸取上清液，转移到另一新离心管，不要吸细胞碎片残渣沉淀。

5、加入0.5倍体积（225 µL）96~100%乙醇，吹打混合均匀。

如果裂解液有损失，则相应减少乙醇用量。

加入乙醇后，可能会出现沉淀，但对提取无影响。

6、将混合液全部（包括沉淀675 µL）转移到吸附RNA的离心柱（粉红色柱），下接一个2 ml收集管，大于8000 g或10000 r/min离心15 sec。

如果混合液体积超过700 µL，每次只加700 µL到离心柱上，按上述条件离心。

弃去管内液体，重复使用收集管。

7、加入700 µL洗脱液，大于8000 g或10000 r/min离心25 sec，弃去收集管。

8、将离心柱转移到一新的2 ml收集管上，加入500 µL RPE液，大于8000 g 或10000 r/min离心15 sec。

弃去管内液体，重复使用收集管。

注意：试剂盒提
供浓缩的PRE洗脱液，所心使用前必须加入4倍体积的96~100%乙醇，成为工作液。

9、加入500 µL RPE液到离心柱上，最大转速离心2 min，干燥离心柱，弃去收集管。

残留乙醇会干扰随后的反应，这次离心要保证无乙醇残留。

若有乙醇残留，以最大转速离心1 min。

注意：小心移去离心柱，不要接触管到液体，以防止携带乙醇。

10、把离心柱连接到一新的1.5 ml收集管上，加入20~30 µL 无RNase水，大于8000 g或10000 r/min离心1 min，洗脱RNA。

若RNA产量在20 μg以上，用30~50 µL无RNase水再洗脱一次。

RNA样品存于－20℃或－80℃冰箱。

11、分光光度计测定RNA。

开启紫外分光光度计，预热30 min。

用DEPC 处理水校正零点。

用DEPC处理水稀释RNA样品30~50倍，将稀释液转移到比色杯中。

读取230、260、280、310 nm的OD值。

计算出样品浓度和OD比值。

OD260/ OD280比值应为1.7~2.1，低于1.7，说明有蛋白质或酚污染；OD260/ OD230比值应大于2，低于此值，说明有糖、盐、胍等小分子污染。

12、琼脂糖凝胶甲醛变性电泳。

首先制备凝胶（1.2%）。

称取1.2 g琼脂糖，加72 ml DEPC处理的水，加热溶化。

冷却至60℃，在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10 ml，甲醛（37%）18 ml，混匀后倒胶。

然后制备样品。

在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液按4:1比例混匀。

65℃温育5~10 min，迅速在冰上冷却5 min，瞬时离心数秒。

上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。

以5 V/cm电压电泳1.5~2 hr。

待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3~4/5处结束电泳。

将凝胶置于溴化乙锭溶液（0.5 µg/mL，用0.1 mol/L乙酸胺配制）中当色约30 min。

紫外灯下观察结果。

1.2.5酚抽提法（全血为例）
实验原理
用酚抽提细胞DNA时，使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚有效变性蛋白质，抑制了DNase的降解作用。

氯仿克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提，去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。

实验步骤
1.200ul的全血/新鲜组织加入1ml的灭菌水，颠倒混匀（新鲜组织需碾磨），10000转离心10分钟，弃上清。

管底应该有沉淀。

重复两次
2.加入200ul的DNA裂解液，5ul的蛋白酶K混匀。

3.55度过夜消化（细胞3小时即可）。

4.消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液（1:1），剧烈震荡，使其变成奶咖色。

5.12000转离心10分钟。

6.取上清，注意不要洗到中间介质以及下层液体。

7.加入等体积的氯仿，颠倒混匀。

8.12000转离心10分钟。

9.取上清，注意不要洗到中间介质以及下层液体。

10.加入10分之一的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀。

11.12000转离心10分钟。

12.弃上清。

13.加入1ml 70%乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次。

14.12000转离心10分钟。

15.弃上清，然后室温开盖静置分钟使其乙醇挥发干净。

16.加入灭菌水溶解DNA，一般加入50ul灭菌水溶解。

1.2.6Trizol法（动物组织为例）
实验原理
Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。

共纯化DNA 对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg 组织，5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。

一个小时内即可完成
反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。

本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的完整性。

保存条件：2~8℃避光保存12个月。

实验试剂
Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用RNase-Free水配制），RNase-Free水。

实验前需要准备的物品：1ml注射器，1.5ml EP管（DEPC处理过），大、中、小号枪头（DEPC处理）
注意事项
1.选择新鲜血液，不得超过4小时。

2.选择新鲜组织，生长旺盛的组织。

3.选择新鲜的幼嫩组织。

4.选择处于生长旺盛的时期收集细胞。

RNA纯化要求
1.纯化后不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的物质。

2.排除有机溶剂和金属离子的污染。

3.蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。

4.排除DNA分子的污染。

RNA提取注意事项
1.杜绝外源酶的污染。

（1）严格戴好口罩，手套。

（2）实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。

（3）实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。

2.阻止内源酶的活性。

（1）选择合适的匀浆方法。

（2）选择合适的裂解液。

（3）控制好样品的起始量。

3.明确自己的提取目的。

（1）任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，提取成功率急剧下降。

（2）RNA提取成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。

Rnase污染的10大来源
1.手指头
2.枪头
3.水/缓冲液
4.实验台面
5.内源Rnase
6.RNA样品
7.质粒提取
8.RNA保存
9.阳离子（Ca，Mg）
10.后续实验所用的酶
实验步骤
1.样品处理：
（1）培养细胞：收获细胞1~5×107，加入1ml Trizol（异硫氰酸胍/酚）（在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol），混匀；用1ml注射器反复抽取（约30次）以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。

（2）组织：取50~100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml EP管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。

2.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液进行下一步操作。

3.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15~30s，静置2~3min。

4.4℃离心，12000g×15min。

样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水。