家畜配子与胚胎生物工程.
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• 去核 • 移核 • 细胞融合
• 活化处理 • 化学激活 • 电激活
• 重组胚移植
转基因动物技术
转基因动物技术
转基因动物技术的发展简史 转基因动物技术的应用与前景 转基因动物技术存在的问题 建立转基因动物的方法 转基因动物的检测
性别鉴定与性别控制
性别鉴定与性别控制
• 性别鉴定
•细胞遗传学方法 •H-Y抗原测定法 •SRY-PCR法性别鉴定 • 性别控制
卵母细胞的采集和选择
➢ 体外成熟的判定 ➢ 影响卵母细胞体外成熟的因素
卵母细胞的培养
➢ 卵母细胞的体外成熟培养系统 基础培养体系 腔前卵泡体外成熟培养系统
发育阻滞现象 体外培养体系
➢ 合成液培养系统 ➢ 共同培养系统
wk.baidu.com
方法之一：解剖显微镜下观察卵丘细胞是否扩展松散, 扩展好的，一般认为是已成熟的卵母细胞。
➢分离培养腔前卵泡研究已在小鼠、仓鼠、大鼠、兔、猫、 猪和牛均有报道，并以小鼠和牛研究较多，但仅在 小鼠获得后代。
精子的预处理 浮游程序（swim up） 玻璃棉过滤程序 BSA/Percoll 密度梯度 透明质酸的作用 精子洗涤 精子浓度
精子活力的提高 咖啡因 PHE 腺苷及其类似物 血小板激活因子
➢培 养 腔 前 卵 泡 培 养 基 主 要 有 MEM,GMEM,TCMl99 和 Wavmouth MB752/l 培养基等。
➢培养基中添加血清、成熟分裂抑制剂、促性腺激素、类 固醇激素和生长因子等。
➢培养方法有微滴法、琼脂包埋培养法、胶原蛋白铺层培 养法(二维法)和胶原蛋白包埋培养法(三维法)。
✓胚胎移植前后所处环境的同一性 ✓分类学上的相同属性 ✓生理上的一致 ✓解剖部位的一致 ✓胚胎收集的期限 ✓胚胎的质量保证
✓主要指母畜的生理状况。 ✓供体要具较高的育种价值、对超数排卵反应良好。 ✓受体要具有良好的繁殖性能、体型要大。
方法的改进： 1、 PMSG方面 2、 FSH方面 3、 其他方面
➢添加犊牛血清、发情牛血清、胎牛血清、发情山羊血清或牛血白 蛋白(BSA)等。使用浓度5％～10％，BSA浓度3～5mg／mL
➢添加促性腺激素，主要有HCG或PMSG、FSH+LH。添加雌激素对 卵母细胞体外成熟的影响尚存分歧。添加发情牛血清、发情 山羊血清时，主张无激素培养法。
➢基础培养液中添加卵泡液(BFF)、颗粒细胞或中糖卵管上皮细胞利 于卵母细胞体外成熟。
•免疫分离精子法 •用流式细胞分类仪分离精子
本章结束！
胚胎移植(Embryo Transfer，ET)又称受精卵移植，是把 一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内冲洗出来， 移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使之继续 发育成新个体的技术。其中提供胚胎的动物称为供体 （Donor），接受和孕育胚胎的动物称为受体(recipient)。
方法之二：是用吸管吹打法或透明质酸酶分解法除去卵 丘细胞，以观察在卵周隙中是否有第一极体，但要 观察第Ⅱ次减数分裂(MⅡ)中期的核，需制片染色。
方法之三：采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵 丘卵母细胞复合体。任何方法采集的COC都要求卵 母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细 胞紧密包围(图示1、图示2）。
»抗冷冻保护剂 »胚胎冷冻的主要方法
控温冷冻保存 玻璃化冷冻
抗冷冻保护剂 胚胎冷冻所用的保护剂主要分为三类： (1)渗透性的：丙三醇、DMSO、乙二醇、丙二 醇、乙酰胺等； (2)非渗透性的：葡萄糖、聚蔗糖、葡聚糖、牛 血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FCS)、聚乙烯吡 咯烷酮(PVP)等；
家畜配子与胚胎生物工程
胚胎移植
家畜胚胎移植概论
• 胚胎移植的概念及基本操作过程 • 胚胎移植在畜牧生产上的意义 • 胚胎移植的生理学基础和原则
生理学基础 胚胎移植的基本原则
胚胎移植的技术程序
• 供体母畜和受体母畜的选择 • 超数排卵 • 供体母畜的配种 • 胚胎的收集（手术法、非手术法） • 胚胎的评定(正常胚胎、形态异常胚胎) • 胚胎的保存和培养
影响卵母细胞体外成熟 的因素
A. 动物的种类不同； B. 卵母细胞类型； C. 卵泡直径与卵母细胞体外成熟能力有关； D. 卵母细胞离体操作的时间和条件； E. 采卵季节有关；
➢基础培养液以合成培养液如TCMl99应用最多。缓冲体系以Hepes 或 碳 酸 氢 盐 缓 冲 系 (Earle’s Salts) 为 好 ， 而 磷 酸 盐 缓 冲 系 (Hank’s) 较差。培养条件是5％CO2、95％空气饱和湿度，多 采用微滴法(100μL, l0～15个卵母细胞) 。
– 胚胎冷冻、移植 – 具体操作
体外受精技术
体外受精
卵母细胞的采集和成熟培养 体外受精过程 精子的处理 受精方法 影响体外受精效果的因素 胚胎培养
克隆与核移植
胚胎分割
胚胎分割
胚胎分割的方法 影响分割胚发育的因素
分割胚的发育
胚胎分割技术的应用
核移植
核移植
• 供体细胞的准备 • 受核细胞的准备和去核
谷胱甘肽 己酮可可碱和茶碱 体外获能处理方法 肝素处理 高离子强度液处理 高pH 值处理 黄嘌呤 咖啡因处理 牛卵泡液 猪卵泡液 子宫液、输卵管液 精子活力激动剂 钙离子载体处理
➢调 整 获 能 精 子 浓 度 ， 制 成 小 滴 ， 覆 盖 石 蜡 油 ， 经 培 养 30 ～ 60min。将体外培养成熟的卵母细胞加入与之共孵育。精 卵共孵育时间与受精体系有关。洗去多余精子和卵丘 细胞，转移至受精卵培养液中继续培养。受精卵标志 是雌、雄原核，排出第二极体，或发育到卵裂期胚胎。
胚胎移植的意义从根本上说就是缩短优良母畜的繁殖 周期，增加一次生产后代的数量。因此与其相关的工 作都会用到此项技术，例如家畜育种中对优良畜种的 大量生产、对稀有品种的迅速扩繁等。同时由于家畜 胚胎的可携带性，又使其可以代替活畜进口，由于胚 胎不依赖于母畜的直接接触，这样就可以防止疾病的 传播。
✓母畜发情后生殖器官的孕向发育 ✓早期胚胎的游离状态 ✓胚胎移植与免疫排斥的影响 ✓胚胎的遗传特性
• 活化处理 • 化学激活 • 电激活
• 重组胚移植
转基因动物技术
转基因动物技术
转基因动物技术的发展简史 转基因动物技术的应用与前景 转基因动物技术存在的问题 建立转基因动物的方法 转基因动物的检测
性别鉴定与性别控制
性别鉴定与性别控制
• 性别鉴定
•细胞遗传学方法 •H-Y抗原测定法 •SRY-PCR法性别鉴定 • 性别控制
卵母细胞的采集和选择
➢ 体外成熟的判定 ➢ 影响卵母细胞体外成熟的因素
卵母细胞的培养
➢ 卵母细胞的体外成熟培养系统 基础培养体系 腔前卵泡体外成熟培养系统
发育阻滞现象 体外培养体系
➢ 合成液培养系统 ➢ 共同培养系统
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方法之一：解剖显微镜下观察卵丘细胞是否扩展松散, 扩展好的，一般认为是已成熟的卵母细胞。
➢分离培养腔前卵泡研究已在小鼠、仓鼠、大鼠、兔、猫、 猪和牛均有报道，并以小鼠和牛研究较多，但仅在 小鼠获得后代。
精子的预处理 浮游程序（swim up） 玻璃棉过滤程序 BSA/Percoll 密度梯度 透明质酸的作用 精子洗涤 精子浓度
精子活力的提高 咖啡因 PHE 腺苷及其类似物 血小板激活因子
➢培 养 腔 前 卵 泡 培 养 基 主 要 有 MEM,GMEM,TCMl99 和 Wavmouth MB752/l 培养基等。
➢培养基中添加血清、成熟分裂抑制剂、促性腺激素、类 固醇激素和生长因子等。
➢培养方法有微滴法、琼脂包埋培养法、胶原蛋白铺层培 养法(二维法)和胶原蛋白包埋培养法(三维法)。
✓胚胎移植前后所处环境的同一性 ✓分类学上的相同属性 ✓生理上的一致 ✓解剖部位的一致 ✓胚胎收集的期限 ✓胚胎的质量保证
✓主要指母畜的生理状况。 ✓供体要具较高的育种价值、对超数排卵反应良好。 ✓受体要具有良好的繁殖性能、体型要大。
方法的改进： 1、 PMSG方面 2、 FSH方面 3、 其他方面
➢添加犊牛血清、发情牛血清、胎牛血清、发情山羊血清或牛血白 蛋白(BSA)等。使用浓度5％～10％，BSA浓度3～5mg／mL
➢添加促性腺激素，主要有HCG或PMSG、FSH+LH。添加雌激素对 卵母细胞体外成熟的影响尚存分歧。添加发情牛血清、发情 山羊血清时，主张无激素培养法。
➢基础培养液中添加卵泡液(BFF)、颗粒细胞或中糖卵管上皮细胞利 于卵母细胞体外成熟。
•免疫分离精子法 •用流式细胞分类仪分离精子
本章结束！
胚胎移植(Embryo Transfer，ET)又称受精卵移植，是把 一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内冲洗出来， 移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使之继续 发育成新个体的技术。其中提供胚胎的动物称为供体 （Donor），接受和孕育胚胎的动物称为受体(recipient)。
方法之二：是用吸管吹打法或透明质酸酶分解法除去卵 丘细胞，以观察在卵周隙中是否有第一极体，但要 观察第Ⅱ次减数分裂(MⅡ)中期的核，需制片染色。
方法之三：采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵 丘卵母细胞复合体。任何方法采集的COC都要求卵 母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细 胞紧密包围(图示1、图示2）。
»抗冷冻保护剂 »胚胎冷冻的主要方法
控温冷冻保存 玻璃化冷冻
抗冷冻保护剂 胚胎冷冻所用的保护剂主要分为三类： (1)渗透性的：丙三醇、DMSO、乙二醇、丙二 醇、乙酰胺等； (2)非渗透性的：葡萄糖、聚蔗糖、葡聚糖、牛 血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FCS)、聚乙烯吡 咯烷酮(PVP)等；
家畜配子与胚胎生物工程
胚胎移植
家畜胚胎移植概论
• 胚胎移植的概念及基本操作过程 • 胚胎移植在畜牧生产上的意义 • 胚胎移植的生理学基础和原则
生理学基础 胚胎移植的基本原则
胚胎移植的技术程序
• 供体母畜和受体母畜的选择 • 超数排卵 • 供体母畜的配种 • 胚胎的收集（手术法、非手术法） • 胚胎的评定(正常胚胎、形态异常胚胎) • 胚胎的保存和培养
影响卵母细胞体外成熟 的因素
A. 动物的种类不同； B. 卵母细胞类型； C. 卵泡直径与卵母细胞体外成熟能力有关； D. 卵母细胞离体操作的时间和条件； E. 采卵季节有关；
➢基础培养液以合成培养液如TCMl99应用最多。缓冲体系以Hepes 或 碳 酸 氢 盐 缓 冲 系 (Earle’s Salts) 为 好 ， 而 磷 酸 盐 缓 冲 系 (Hank’s) 较差。培养条件是5％CO2、95％空气饱和湿度，多 采用微滴法(100μL, l0～15个卵母细胞) 。
– 胚胎冷冻、移植 – 具体操作
体外受精技术
体外受精
卵母细胞的采集和成熟培养 体外受精过程 精子的处理 受精方法 影响体外受精效果的因素 胚胎培养
克隆与核移植
胚胎分割
胚胎分割
胚胎分割的方法 影响分割胚发育的因素
分割胚的发育
胚胎分割技术的应用
核移植
核移植
• 供体细胞的准备 • 受核细胞的准备和去核
谷胱甘肽 己酮可可碱和茶碱 体外获能处理方法 肝素处理 高离子强度液处理 高pH 值处理 黄嘌呤 咖啡因处理 牛卵泡液 猪卵泡液 子宫液、输卵管液 精子活力激动剂 钙离子载体处理
➢调 整 获 能 精 子 浓 度 ， 制 成 小 滴 ， 覆 盖 石 蜡 油 ， 经 培 养 30 ～ 60min。将体外培养成熟的卵母细胞加入与之共孵育。精 卵共孵育时间与受精体系有关。洗去多余精子和卵丘 细胞，转移至受精卵培养液中继续培养。受精卵标志 是雌、雄原核，排出第二极体，或发育到卵裂期胚胎。
胚胎移植的意义从根本上说就是缩短优良母畜的繁殖 周期，增加一次生产后代的数量。因此与其相关的工 作都会用到此项技术，例如家畜育种中对优良畜种的 大量生产、对稀有品种的迅速扩繁等。同时由于家畜 胚胎的可携带性，又使其可以代替活畜进口，由于胚 胎不依赖于母畜的直接接触，这样就可以防止疾病的 传播。
✓母畜发情后生殖器官的孕向发育 ✓早期胚胎的游离状态 ✓胚胎移植与免疫排斥的影响 ✓胚胎的遗传特性