PCR技术及其在动物胚胎性别鉴定中的应用研究

PCR技术及其在动物胚胎性别鉴定中的应用研究黄国清　潘 珂 陈　颖
(江西农业大学动科院　南昌330045)　(江西民星企业集团)
PCR(Polymerarse Chain Reaction)为聚合酶链式反应或体外扩增技术,是1985年美国Cetus公司人类遗传部、加利福尼亚大学洛杉矶和Howghes医学院等联合创建的一项体外酶促扩增DNA新技术,具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点,现已广泛用于生物医学、传染病原、遗传缺陷、畜禽疾病诊断、考古学等许多领域。

最近一些年来,国内外将PCR技术用于鉴别哺乳动物胚胎的性别,并取得了不少成果。

现将PCR技术发展及其在动物胚胎性别鉴定上的应用作一概述。

1　PCR技术的基本原理
PCR技术原理类似于天然DNA的复制,主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA的特性,模仿体内的复制过程,在附加的一引物之间诱发聚合酶反应。

PCR全过程包括DNA模板变性、退火、延伸3个步骤的若干次循环。

首先是双链态的靶DNA在高温作用下变性解链,产生单链DNA;然后降低温度使人工合成的2个寡核苷酸引物分别与各自的互补DNA杂交(退火)而定靶DNA的特定区域;在Taq DNA聚合酶的作用下,在4种dDNA底物存在时,引物链将沿着5′～3′方向延伸与模板互补形成新链。

新合成的引物延伸链经高温变性后又可作为模板参与下一轮循环,结果使靶DNA分子量呈指数增多。

2　PCR技术的研究进展
PCR技术建立后几年里,发展相当快,取得了突破性进展,特别是它的临床诊断研究已遍及全世界,下面将介绍近年来推出的PCR新方法。

2.1　不对称PCR(Asymmetric PCR)
在PCR反应系统中加入不同量的两引物,经若干循环后,量少的一种引物消耗完毕,只剩1种引物参与以后的循环反应,结果可获得DNA两条链浓度不等的放大产物。

当两引物的克分子浓度相差很大时,就可获得1条单链的浓度大大高于另一条单链的放大产物。

这个方法又称不平衡PCR增殖反应。

它可用于制备单链探针,DNA序列分析及用于研究真核DNA外显子。

2.2　复合PCR(Multiplex PCR)
复合PCR技术就是在一个反应环境中,同时加入多对不同的引物,从而获得最大效率的PCR产物。

也就是说,在PCR反应系统中,用多组引物同时放大多个基因。

最新的复合PCR反应记录是由Chamberiain创造的,采用9套不同的引物,从而得到DMD基因片段。

为了获得特异性高的PCR产物,最好用2对套叠的引物。

2.3　倒转PCR(Inverted PCR)
常规PCR是扩增2个引物之间的DNA片段,倒转PCR是用反链的互补引物来扩增2个引物以外的DNA片段。

此技术主要用于分析DNA序列未确定的情况。

2.4　连接子PCR
在引物的5′端引入一个含有限制性酶切位点的寡核苷酸序列(原模板中没有的),经PCR后扩增产物的5′端就带上了这段序列。

一些连接子可以与DNA片段的末端连接,利用它可以进一步将片段克隆到载体分子上。

215　标记PCR
PCR扩增时是利用4种单核苷酸(dN TP),若底物中的单核苷酸用放射性同位素、生物素、地高辛等标记,那么通过PCR扩增,可以获得标记的PCR 产物,直接作为核酸杂交的探针。

216　两步控温法PCR
常规PCR均采用三步控温法,即94℃解链, 55℃退火,72℃延伸。

两步控温法PCR就是将引物退火和链延伸合为一步(退火延伸57℃),在扩增效果上与常规三步控温法相同。

由此可缩短扩增时间,简化操作步骤。

217　重组RNA—PCR(Recombinant　PCR)将RNA探针序列整合到MDV—IRNA分子中去,这样获得的重组RNA分子具有2种功能,一可通过RNA探针序列与特异性靶DNA序列杂交;二可作为Qβ复制酶的模板,在Qβ复制酶催化下,单
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链重组RNA分子可作为模板直接合成互补的单链都可以从复制复合中释放出来,两者又可处于游离状态而作为下一次合成的模板。

如此反复,重组RNA分子拷贝数就按一定的指数式增加。

3　PCR技术在动物胚胎性别鉴定中的应用
1990年英国学者Sinclair和Gubbay发现哺乳动物(包括人类)Y染色体短臂上存在性别决定区(sex deterrning region of the Y,简称SR Y)。

K oop2 man(1991)把SR Y基因转移到雌性小鼠(XX)胚胎中,结果小鼠发育为雄性,从而证明了SR Y为哺乳动物的性别决定基因。

SR Y的发现被评为1990年世界十大科技成就之一,是生命科学的一项重大突破。

澳大利亚首先成功地采用PCR技术在体外扩增牛Y染色体特异DNA片段鉴别奶牛胚胎性别,准确率高达90%以上。

我国也是在奶牛方面最先应用此技术做出了杰出的贡献。

1991年,上海市儿童医院医学遗传研究所和北京农学院合作,首先应用DNA直接测序法测定了牛SR Y基因的核心序列,测序结果表明,在SR Y核心序列中,牛与小鼠有75%相同,与人类有84%相同。

在此基础上设计合成了牛SR Y序列的特异PCR扩增引物,鉴定了17枚(4只全胚,11只切割胚,2只三分胚)奶牛胚胎,移植5枚分割鉴定的胚胎。

他们参照国外研究报道对牛SR Y序列进行扩增:(1)引物:根据牛的SR Y 序列测定的结果,设计出特异于牛SR Y而对兔、鼠等哺乳动物和人的SR Y序列不特异的二对PCR引物A、B和C、D,用作牛SR Y序列的特异性扩增。

(2)白细胞DNA扩增:对SR Y序列的PCR扩增采用引物A、B和C、D,反应液25μL,模板2.5ng,反应条件为变性—90℃,30s,退火—55℃,30s,延伸—70℃,15min,共反应30个周期。

(3)胚胎DNA扩增∶解冻的全胚或分割胚经生理盐水洗涤后,加4倍去离子水,沸水中加热10min,离心吸出上层的胚胎DNA释出液,按下列两种方式进行PCR扩增:一次扩增—胚胎DNA释出液按白细胞DNA扩增条件用引物A、B进行PCR反应,共反应50个周期;二次扩增按一次扩增条件用引物A、B进行PCR反应至20个周期时,取1/25的PCR产物作DNA模板,改用引物C、D进行PCR反应共35个周期;(3)扩增DNA的检测:扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电脉,经溴化乙锭染色后,观察牛SR Y特异DNA片段;白细胞DNA和胚胎DNA的PCR扩增产物与末端标记的特异于牛SR Y的ASO探针进行点杂交,以验证扩增的SR Y序列。

结果表明,凡是有特异扩增带的均出现阳性的杂交结果(雄性后代),无特异扩增带的PCR产物为阴性杂交结果(雌性后代),证明扩增的为SR Y特异DNA片段。

他们采用这种方法来鉴定牛胚胎性别,性别符合率为100%,产下的牛犊与鉴定的结果完全一致。

目前已建立了用聚合酶链反应鉴定各种动物胚胎性别的方法,包括牛(Peura等,1991;曾溢滔等, 1991;Avery等,1992;刘云海等,1993;K irkpatrick 等,1993),猪(Fajfar Whetston等,1993),人(Handy2 side等,1989、1990)和小鼠(Bradbury等,1990)。

这种方法比较简单,快速、准确、经济,其中有些方法只要1种Y-染色体特异性引物(Handyside等,1989、1990;Bradbury等,1990;Han等,1993)。

另外一些方法除了一对染色体或X-染色体引物外,还包括一对常染色体或X-染色体引物,并将其产物作为PCR方法的阳性对照(Peura等,1991)。

Pomt (1995)实验室建立的SR YA或SR Y B引物的SR Y/ ZF Y-ZFX双扩增体系,具有可扩增多种动物的优点,用其中1种方法成功地扩增了多种动物,包括牛、绵羊、山羊、驼羊、马、人、狒狒、狗、猫、大鼠和小鼠的染色体DNA样品。

由于这种SR Y/ZF Y-ZFX PCR 双扩增体系可扩增如此众多动物的DNA,因此可以用来鉴别多种哺乳动物的性别。

应用PCR技术鉴定胚胎性别的研究成功,使胚胎性别鉴定进入了一个崭新的发展阶段,展示今后的美好发展前景。

但是,只有进一步研究简易快速胚胎切割取样技术和胚胎性别鉴定的PCR检测试验盒以及经切割取样性别鉴定后的胚胎冷冻保存这三个技术关键,才能达到实用化的应用阶段。

1995年中国农科院畜牧研究所与农业部动物检疫所在实验室将Y—DNA特异片段引物、dN TP和Tag酶等反应物按每个胚胎样品需25μL PCR反应物为基数,按比例配制了试剂盒。

进行冷冻保存的试剂盒,可取得与常规PCR检测操作技术方法的相同效果和准确率;采用快速冷冻的方法,冷冻保存切割取样性别鉴定后的胚胎,取得了57%的成功率。

检测结果证明,PCR反应成份中最主要的引物和Tag酶,经稀释和冷冻保存后,并未降低其原来的活性,因此在实验室预先制备PCR试剂盒对胚胎样品进行性别鉴定的方法是可行的,不仅可提高胚胎性别鉴定的准确率,而且可使这一技术进一步实用化。

动物胚胎性别鉴定和性别控制具有重大经济价值,随着PCR鉴定胚胎性别技术的不断改进和简化,相信在不久的将来这项技术将会在畜牧业生产中得到应用和推广。

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主要参考文献
1　Laor O,Torgersen J,et al.Detection of FMDVRNA am pli2 fied by the PCR.Journa of virological methods,1992,36: 197.
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Reprod.Fert.1993,98:335～340.
5　曾溢滔,等1应用PCR扩增牛SR Y序列进行奶牛胚胎性别鉴定.中国科学(B辑),1993,14(3):371～376.
6　瞿文学,等.雄牛特异的SR Y同源序列的扩增和分析.生物工程学报,1993,9(2):107～112.
7　东庸介,等.利用聚合酶链反应技术新发现的牛雄性特异性DNA片段.国外畜牧科技,1992,19(2):8～10.
隐性白羽祖代肉鸡的引种饲养观察 吾豪华　黄峰岩 谢金防 黄礼木饶国荣柳鸿毅
(江西省畜牧兽医局　330046)　(江西省农科院) (江西省种鸡场)
1996年9月,江西中国乌鸡研究开发中心从以色列卡比尔(Kabir)种鸡有限公司引进隐性白羽祖代肉鸡K2700和K900母鸡各500羽,为了观察它们的生产性能和在本地适应情况,我们对这2个品系的饲养管理、生长发育和早期产蛋性能进行了观察测试和资料汇总。

现报告如下:
1　饲养管理
111　育雏育成期(0～18周龄)饲养管理
11111　饲养方法:采用高床网上平养,饲养密度为0～5周龄每平方米20羽,6～18周龄每平方米12羽。

11112　雏鸡保温:采用温室育雏,第1周温度为33～34℃,第2周30～32℃,第3周26～28℃,以后每天降低2℃,至脱温为自然温度,但保持室内温度不低于15℃。

11113　光照措施:1日龄24h光照,2～3日龄为23h,4日龄为20h,第5日龄开始为自然光照。

11114　饲料及营养水平:全期采用江西省种鸡场饲料分厂生产的赣宝牌全价配合料。

35日龄前用Ⅰ号小鸡料,含粗蛋白20%～22%,代谢能12.33～12.54MJ,钙1%、磷0.74%,粗纤维不高于4%;35日龄以后用Ⅱ号中鸡料,含粗蛋白16%～17%,代谢能11.29～11.70MJ,钙1%、磷0.66%,粗纤维不高于5%。

11115　防疫措施:因鸡苗由以色列空运至北京,再从北京空运到南昌,途中运输时间较长,进栏时用速补—14饮水2次。

免疫程序如下:12日龄ND La2 sota苗点眼滴鼻,注射0.2mL ND油乳剂灭活苗,15日龄IBD中等毒力疫苗滴口,18日龄H120苗点眼滴鼻,20日龄IBD苗2倍剂量滴口,35日龄Ft剌种, 50日龄H50饮水,60日龄NDZ疫苗注射,120日龄ND-IBD-EDS三疫苗灭活油苗肌注。

3日龄开始用恩诺沙星饮水剂连饮5d。

112　产蛋期(11～65周)
11211　饲养方式:开放式鸡舍2层阶梯笼养, K2700为单笼饲养,K900为每笼养2只鸡。

11212　光照制度:采用自然光照加人工光照,具体光照时数为:19～20周龄自然光照,22周龄14.5h,以后每周增加0.5d,至27周龄17h保持不变。

11213　饲料及营养水平:饲料采用江西省种鸡场饲料分厂生产的赣宝牌产蛋Ⅱ、Ⅲ号料,饲料营养水平为:前期(19～40周)用Ⅱ号料,粗蛋白16%,代谢能11.5MJ,粗脂肪3%,钙3%,有效磷0.45%;后期(41～65周)用Ⅲ号料,粗蛋白15%,代谢能11.3MJ,粗脂肪3%、钙3%、有效磷0.45%。

2　结果
211　育雏育成
21111　K900隐性白羽祖代母鸡数量500羽,路途补损3%,实际数量为515羽,途中实际死亡4羽,
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