共生法培养外生菌根菌菌丝体

共生法培养外生菌根菌菌丝体
黄光文1,张　平2
(1.湖南科技学院生命科学与化学工程系,湖南　永州　425006; 2.湖南师范大学真菌研究室,长沙　410081)
摘要:首次报道外生菌根菌的共生培养法。

初步研究了一个较好的外生菌根菌菌丝体培养方法,即将宿主的愈伤组织与外生菌根共同培养,可以明显地促进真菌菌丝的萌发和生长。

愈伤组织匀浆液也可促进菌丝体早期生长。

关键词:共生培养法;鹅膏菌;外生菌根菌;菌丝体
中图分类号:S646 文献标识码:A
文章编号:1003-8310(2005)03-0016-02
1　材料与方法
111　材料
宿主植物:石栎(Lithocarpus glaber(Thunb.) Nakai),采自长沙县星沙镇,有鹅膏菌共生。

菌根真菌:假褐云斑鹅膏(Amanita pseudopor2 phyria H ong o)、黄盖鹅膏白色变种(A.subjunquillea var.alba Zhu L.Y ang)、欧氏鹅膏(A.ober winkler2 ana Zhu L.Y ang&Y oshim.D oi)。

经组织分离纯培养而来,并经RAPD鉴定[1]。

112　培养基
11211　改良MS培养基:K NO3119g,NH4NO31165 g,K H2PO40117g,CaCl2・H2O0144g,MgS O4・7H2O 0137g,FeS O4・7H2O2718mg,Na2E DT A・H2O3713 mg,H3BO3612mg,ZnS O4・5H2O816mg,MnS O4・H2O1619mg,Na2M oO4・2H2O0125mg,KI0183mg, CaS O4・5H2O01025mg,C oCl201025mg,肌醇100 mg,甘氨酸210mg,盐酸硫氨素014mg,烟酸015 mg,盐酸吡哆醇015mg,琼脂18g,蔗糖23g,胡萝卜100g(煮汁),加水至1000m L。

11212　菌丝生长培养基:上述培养基中加入葡萄糖2g、蛋白胨2g、麦芽汁(12波美度)20m L。

113　愈伤组织培养方法
改良MS培养基附加2,4-014mg・L-1或6-BA018mg・L-1,24℃/20℃(日/夜)下自然光照。

详见文献[2]。

114　菌丝培养方法
对照:用打孔器打出直径为015cm的菌丝块接入装有40m L菌丝生长培养基的100m L三角瓶中,于20℃下培养,各设10瓶。

测定萌发时间(以肉眼明显可见菌丝外伸为度),萌发后每10d 量一次菌丝长度。

(下同)
方法A:在改良MS培养基中加入经过过滤除菌的菌根浸出液(菌根重量与组织块重量一致)作为生长刺激因子。

方法B:菌丝块接种于(紧贴)愈伤组织旁(即共培养方法)。

方法C:将愈伤组织全部挑出,在剩下的改良MS培养基上接入菌丝块。

方法D:无菌状态下将愈伤组织研磨成匀浆,加入到新的菌丝生长培养基中后接种真菌。

2　结果与分析
实验结果显示,四种方法培养的菌丝在萌发速度(图1)和生长速度(图2)上比对照均有不同程度的提高,其中方法B即共培养方法的效果最为显著。

从图3可以看出,菌丝在改良培养基上的生长比较均衡,在前30d逐渐缓缓加快,然后缓缓减慢。

愈伤组织匀浆、菌根提取液和愈伤组织分泌物对菌丝的前期生长有较好的刺激效果,效果依次减小,但相关不大。

三种刺激物作用一段时间后失去影响。

而共培养的菌丝生长速度比其他四者均高,而且在生长后期效果依然显著。

不同的菌株对刺激因子的反映程度略有不同,但总的趋势一致。

图1　菌丝萌发时间的比较
注: A.pse=假褐云斑鹅膏(A.pseudoporphyria);
A.sub=黄盖鹅膏白色变种(A.subjunquillea); A.obe=欧氏鹅膏(A.oberwinklerana)
3　讨论
从实验结果看,菌丝体的共培养法是促进外生
收稿日期:2004-10-18
基金项目:国家科委重点课题项目(96-C02-03-07);湖南省教育厅课题(03C358)
61中国食用菌　E DI BLE FUNGI OF CHI NA V ol124,N o13
图2　五种不同培养方法的菌丝平均生长速度的比较注:同图
1
图3　五种不同培养方法的菌丝生长速度曲线图
菌根菌菌丝生长的十分有效的方法。

此方法以前未见报道。

由于外生菌根菌适应了与宿主植物的共生生活,在人工培养基上生长会受到抑制。

人们研究外生菌根和外生菌根菌时常常需要解决菌丝体的生长问题。

因此能有效促进菌丝体生长的培养条件一直是研究者们所追寻的。

本方法为改良外生菌根菌培养方法提供了一个很有益的思路。

但是,宿主植物的愈伤组织本身的培养在很多树种中尚在摸索
中。

受此影响,此方法在大量培养菌丝时还不完善,有必要进一步研究。

菌根浸出液和愈伤组织浆对菌丝生长的促进作用推测是因为其中所含的激素、降解核酸和蛋白质等成分。

因为降解蛋白质、氨基酸、核酸成分和一些激素可促进菌丝生长[3]。

而前者比后者作用小,可能是菌根上的菌丝在研磨中产生了自融的废物。

愈伤组织挑走后的培养基对菌丝也有生长作用表明,愈伤组织在生长过程中向培养基分泌一些有益物质,可能是许多酶和多种其他化合物,从而可以促进菌丝生长,也说明共培养方法是可行的。

但培养基中的附加物2,4-D 、6-BA 和NAA 对菌丝生长没有影响[4]。

共培养法的菌丝比其他方法在后期生长中要好,是因为其他方法中刺激因子的消耗,而愈伤组织可以持续地分泌刺激因子。

但究竟有哪些物质在起作用,是进一步研究的内容,。

研究结果将为菌丝对营养根的趋化性研究和直接向培养基中加入刺激物质以促进菌丝快速生长提供重要的参考信息。

愈伤组织也可能会对孢子萌发有刺激作用。

[参考文献]
[1]黄光文,张平,张志光.柯的组织培养[J ].零陵学
院学报.2002,03:81-83.
[2]陈作红,张志光,张平.几种鹅膏菌菌种分离及其
RAPD 鉴定[J ].湖南师范大学学报自然科学版.2000,23(4):56-91.
[3]郭秀珍,毕国昌.林木菌根及应用技术[M].中国
林业出版社.1989.
[4]陈豫.外生菌根真菌鳞柄白毒鹅膏与白毒鹅膏生物学
特性的研究[R].湖南师范大学硕士论文:2000, 5.
Symbiosis -based Culturing :A N e w E ffective Method of Culturing
Ectomycorrhizal Fungi
HUANG G u ang -w en 1,ZH ANG Ping 2
(1.Department of Life Science and Chem istry Engineering ,Hunan Science and T ecinology Institue ,Y ongzhou 425006,China ;2.C ollege of Life Science ,Hunan N ormal University ,Changsha 410081,China )
Abstract :A new method ,C o -culturing ,of culturing ectomycorrhizal fungi is reported for the first time.The ef 2fective method is that ectomycorrhizal fungi are introduced just beside the callus of host plant ,which can evidently upgrade the growth of the hyphae.The callus juice can als o do on the early growth.
K ey w ords :symbiosis -based culturing method ;Amanita ;ectomycorrhizal ;hyphae
声明:
“神经致幻型毒蕈205新菌株的驯化研究试验”(见本刊05年第二期,第13～14页)研究所采用的205菌株,是由西南科技大学的贺新生教授提供,以此致歉。

杜秀菊
2005年3月24日
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1第24卷　第3期 中国食用菌　E DI BLE FUNGI OF CHI NA。