诱导多能干细胞体外分化为心肌细胞研究现状

胎结构含有各种类型分化细胞的细胞群体结构的形成来促进干 细胞分化，之后继续行单层培养，以分化获取心肌细胞。目前应 用比较广泛的方法为后者。下面就目前 iPSC 体外分化生成心 肌细胞并进行治疗应用的研究进行阐述。
一、各类促分化因子的应用 在胚胎发育过程 中，细 胞 从 最 初 的 祖 细 胞 到 前 体 细 胞 及 终 末分化细胞，这一过程受到多种生长、分化因子的调控及外环境 的影响。在 ESC 分化研究中，众多研究者多通过模拟这一体内 的分化过程来促进体外干细胞的分化。随后的 iPSC 分化研究 中，研究者也采用同样的技术手段，应用细胞产生的各类生长因 子或一些小分子化合物来诱导干细胞的定向分化。 在 iPSC 分化为心肌细胞的过程中，加入一些生长因子可以 提高干细胞分化为心肌细胞的效率，其中 Kattman 等［12］发展了 一种通过调节活化素（ Activin） 及骨形态发生蛋白（ BMP） 水平来 影响转化生长因子 β（ TGF-β） 信号因子家族的信号传导，从而达 到高效率 地 诱 导 干 细 胞 产 生 心 肌 细 胞 的 方 法 应 用 最 为 广 泛。 TGF-β 信号因子家族包括 TGF-β、Activin、Nodal、BMP 和生长分 化因子（ GDF） 等，此信号家族在干细胞的干性维持、增殖和干细 胞向各个细胞系分化方面都具有重要的影响。在小鼠胚胎干细 胞分化过程中加入外源性的 Activin A 及 BMP4，可促进以 Flk1 + 及 PdgfR-α + 为特征的心肌前体细胞的生成。此外，在心肌前 体细胞向心肌细胞分化过程中，外源性 Activin A 及 BMP4 亦可 起到促进心肌肌钙蛋白 T（ cardiac troponin T，cTnT） 阳性心肌细 胞的生成比例，其比例最高可超过 65% 。应用类似的方法，Keller 等发现 Activin A 和 BMP4 的组合同样可以高效率地促进人 类 ESC 和 iPSC 向 cTnT + 的心肌细胞定向分化。Keller 小组研究 显示 BMP / Activin 等 TGF-β 家族信号可促进小鼠和人 ESC 及 iPSC 向心肌细胞的定向分化。在分化过程中加入适当浓度的 BMP 和 Activin，诱导生成的 Flk-1 + PdgfR-α + 心肌前体细胞和进 一步分化生成的 cTnT + 心肌细胞获得率可大幅提高，ESC 可提 高至 67% ，而 iPSC 可提高至 65% 。但有报道指出 ESC 及 iPSC 分化所得心肌细胞功能上不够成熟，其在电生理、钙摄取、电冲 动产生、收缩蛋白的表达及肌纤维结构上成熟程度类似于人类 胎儿的心肌细胞。因此研究者对于如何促进干细胞分化所得心 肌细胞成熟度做出了许多尝试，其中各种小分子化学物质取得 了比较乐观的进展。 除了各种生长因 子 外，还 有 许 多 小 分 子 物 质 也 可 促 进 干 细 胞向心肌细胞的分化，这些物质已报道的包括 cardiogenols［13］， 抗坏 血 酸 （ ascorbic acid，AA ） ［14］，isoxazolyl-serines［15］，磺 酰 腙 （ sulfonylhydrazones，SHZ） ［16］ 和 二 甲 基 亚 砜 （ DMSO） 。 ［17］ 其 中 DMSO 是比较早地应用到促干细胞分化为心肌细胞的小分子化 学物质［18］。目前对于 DMSO 促进分化的机制尚不甚明了，但有 研究者注意到在 DMSO 诱导分化时，细胞质内 Ca2 + 会出现大幅 度提升，因此提出 Ca2 + 的代谢或者 Ca2 + 介导的某些传导通路导 致了诱导作 用 发 生。而 AA 和 SHZ 的 促 分 化 机 制 较 为 明 确， Quattrocelli 等［19］在报道中指出 SHZ 可以在分化早期和晚期增
干细胞是一类具 有 自 我 复 制 能 力 的 多 潜 能 细 胞 ，在 一 定 条 件下可以分化为多种类型细胞，因而是目前进行细胞治疗的主 要选择。按照干细胞的发育阶段，其可分为胚胎干细胞（ embryonic stem cell，ESC） 和成体干细胞。ESC 是一种高度未分化细 胞，可以自我更新并具备分化为体内所有细胞类型的能力。但 由于存在伦理学和免疫排斥等问题，ESC 的研究和应用遇到较 大阻力。近年来，诱导多能干细胞（ induced pluripotent stem cell， iPSC） 的出现为干细胞治疗提供了新的细胞来源。2006 年，Takahashi 等［4］通过逆转录病毒导入 4 种转录因子（ Oct3 /4、Sox2、cMyc 和 Klf4） ，成功使成纤维细胞发生重编程后获得具有 ESC 特 性的全能干细 胞。这 种 诱 导 形 成 的 干 细 胞 在 形 态、增 殖 分 化 潜 力、细胞表面抗原、类胚体（ embryonic body，EB） 和畸胎瘤生成能 力等方面与 ESC 极为相似，而又避免了伦理学和细胞免疫排斥， 因此具有很大的应用前景［5-11］。因此这种技术自诞生起就吸引 了众多研究者的目光，对其在体外的分化进行了各个方面的研 究探索。
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中华临床医师杂志（ 电子版） 2012 年 11 月第 6 卷第 22 期 Chin J Clinicians（ Electronic Edition） ，November 15，2012，Vol． 6，No． 细胞研究现状
刘丽 张海波
心力衰竭在欧美的发生率每年都居高不下，是致死的主要 原因之一，在我国随着人口老龄化进展，发生率也在逐年提高， 而成熟心肌细胞是高度分化的终末细胞，受损后不能再生。尽 管 Beltrami 等［1］和 Bergmann 等［2］的研究认为心肌细胞可以通过 心脏内的干细胞分化而增殖再生，但其分裂增殖能力十分有限， 不能达到心肌损伤 后 修 复 心 肌 数 目 和 心 脏 功 能 的 作 用。最 近 Porrello 等［3］经研究发现出生 1 d 的小鼠心肌细胞本身具有较强 的增殖再生能力，然而这种能力在小鼠生长至第 7 天的时候就 消失了，也就是说哺乳动物的心脏在出生后一段时间内有一定 的增殖能力，但这种再生能力随着时间而丧失。因此，通过补充 外源性细胞来进行心肌修复的尝试就成为目前最主要的途径。
一次心肌梗死患者将失去 10 亿心肌细胞，要通过体外分化 补充如此巨 大 数 目 的 心 肌 细 胞，提 高 体 外 分 化 效 率 必 不 可 少。 而且对于心脏来说，心脏起搏细胞、心房肌细胞及心室肌虽然都 由心肌前体细胞分化而来，但它们不仅力学特性不同，而且在电 生理上的特性也相互迥异。如果外源补充的心肌细胞包含有不 同类型，不同细胞类型间的电耦合很有可能导致心律失常的发 生。因此分化生成的心肌细胞必须具有很高的纯度。对治疗心 脏衰竭来讲，重要的是通过心肌细胞再生而恢复心脏的泵血功 能。心脏的泵血功 能 主 要 由 心 室 承 担，因 此 应 用 干 细 胞 进 行 心 脏疾病治疗，要尽可能地将其分化生成单纯的心室肌细胞而恢 复心脏的泵血 功 能。因 此，研 究 者 就 分 化 效 率 及 纯 度 这 两 点 展 开了各种尝试。
对全能干细胞进行分化，其方法一般分为两种，一是直接将 干细胞诱导分化为心肌细胞，二是先通过 EB———一种类似于胚
DOI： 10. 3877 / cma． j． issn． 1674-0785． 2012． 22． 127 作者单位： 200127 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心心 胸外科 通讯作者： 张海波，Email： chang3176@ yahoo． com