发酵工程第3讲

4.2.4 pH：注意种子培养基的C、N比，保持微生物生长 的最适pH 4.2.5 通气和搅拌：种子罐的通气量应适当高于发酵罐 通气量，通气量的大小与所用菌种特性、培养基性质 和菌种的生长阶段有关。 4.2.6 泡沫：泡沫影响微生物生理代谢的正常进行，甚
至会导致跑料、染菌。因此，必须注意种子罐的消泡。
加工方法和用量。
4.1.2 培养温度和湿度：培养温度对多数菌种的孢子质 量有显著影响，孢子培养的最适温度区间非常狭窄， 切忌高温。 培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数 量和质量有很大影响，
空气相对湿度高，培养基内的水分蒸发少，反之则蒸 发多。一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌要
求偏低。实验室最好用调温调湿培养箱培养孢子。
3.2. 种子培养基选择的原则
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于 发酵培养基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化
4
影响种子质量的因素 优劣主要取决于菌种的遗传特性和培养条件两方面。 4.1 影响孢子质量的因素 4.1.1 培养基：孢子培养基所用的原材料的产地、品种、
种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的
4.1.3
培养时间和冷藏时间：孢子的培养时间应控制在
孢子量多、成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。冷 藏时间对孢子质量也有影响，总的原则是冷藏时间宜 短不宜长。
4.1.4
接种量：凡接种后菌落均匀分布于整个斜面、隐
约可分菌落者为正常的接种量。
4.2 影响种子质量的主要因素
摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度或黏
酵罐发酵，此为三级发酵。 工厂一般从第一级种子罐开始计算发酵级数。但也有 由菌丝体培养开始计算发酵级数。
3.1.2 种龄与接种量： 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少，造成发酵前期生长缓慢；种龄长：
易老化，菌体自溶，生产能力下降。最终由实验结果
定。 放线菌、霉菌一般40h左右，细菌一般7 ～ 10 h。

不同菌种或同一菌种工艺条件不同，最佳种龄是不一 样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌 生产碱性蛋白酶，12小时最好。

接种量＝
移入种子的体积 ———————— 接种后培养液的体积
接种量过大过小都不好，过大会引起溶氧不足，影响产
2.3
细菌的制备
制备斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 牛肉膏、蛋白胨是常用的氮源。细菌一般为37 ℃，少
28 ℃，培养1 ～ 2天，产孢子的细菌培养5 ～ 10天。
3、 生产车间种子的制备（种子罐种子的制备） 3.1 种子罐种子的制备 3.1.1 种子罐级数的确定 种子罐是将有限的孢子或菌丝生长并繁殖成大量的菌丝
体。一般应根据菌种生长特性、孢子发芽和繁殖速度以 及采用的发酵罐的容积来确定种子罐的级数。

对于生长快的细菌，如谷氨酸生产采用斜面或摇瓶种
子接入种子罐后直接移种到发酵罐，即二级发酵。对
于生长较慢的放线菌、霉菌一般在种子制备过程中需 更换一次培养基以获得大量粗壮的菌体，即经过二级
种子（更换培养基、分段控制）的培养，再移种到发
物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会 延长培养时间，降低发酵罐的生产率。最终以实践定 如大多数抗生素为7 ～ 15%。但是一般认为大一点好。 具体情况应具体对待，摇瓶种子接到一级罐一般在
0.1% ～ 2%，
谷氨酸为1%左右。
双种：两个种子罐种子接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
外观，是种子质量重要的指标。 变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映。 种子生产能力及成熟程度的重要指标。
6 发酵生产的无菌接种
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面： 从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一级种子罐，
从一级种子罐移入二级种子罐或生产发酵罐中。
从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种：压差法
谢
休眠状态的生产菌种经试管斜面活化后，再经过茄子瓶或
摇瓶及种子罐扩大培养而获得一定数量活力旺盛的纯种过 程。
1.2
优良种子必须具备的基本条件
种子的优劣对发酵生产起关键作用。因此必须制备优
良种子。
1.2.1 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速 生长，迟缓期短 1.2.2 生理性状稳定，生长过程稳定 1.2.3 无杂菌污染，确保整个发酵过程正常进行
培养基一般选：麸皮、蛋白胨、一般用摇瓶种子接入
种子罐，也可用一、二级孢子悬液接入种子罐。
2.2
霉菌类孢子的制备
霉菌类孢子的制备多采用大米、小米、玉米、麦麸等
天然农产品为培养基原料。这类培养基表面积大，可
产生大量的孢子，转入种子罐中。 霉菌的培养温度一般为25 ℃ ～ 28 ℃ ，培养时间随 菌种而不同，一般为4d ～ 14d。注意培养过程中翻 动培养瓶。 制备好的米孢子，在4 ℃冰箱保存备用，或将大（小） 米孢子在真空情况下除去水分（抽到含水量在10%以 下），保存备用。

3 发酵用无菌空气的标准 3.1 空气流量用VVM表示，即单位时间（min)内，单 位体积（ m3 ）培养基中通入无菌空气的体积 （m3 ）。范围一般在0.2—2 3.2 无菌空气的压力一般为0.2—0.4MPa 3.3 无菌空气的相对湿度≤70%

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3.4 无菌空气的温度可比培养温度高10—30℃
3.5 可以把100级作为无菌空气的洁净指标。100级 指每立方米空气中，尘埃粒子数最大允许值 ≥0.5μ m的为3500，≥5μ m的为0；微生物最大允许 数为5个浮游菌/ m3 ，1个沉降菌/ 皿.30min。
第五章
1、概述
1.1
种子的制备过程
种子的扩大培养的目的
种子的扩大培养是指将保存在沙土管、冷冻干燥管中处于
谢！
度以及糖氮代谢、pH变化等为指标。
4.2.1 培养基：种子培养基的营养成分要适当丰富和完 全，氮源和维生素含量适当高些，特别是无机氮源， pH要比较稳定，以适合菌的生长和发育。 4.2.2 种龄与接种量：应以菌种的对数期为宜。接种量
具体情况应具体对待。
4.2.3 温度：按微生物生长的最适温度控制，注意微生 物不同生长阶段的温度变化。
4.2.7 染菌的控制：染菌是种子培养的大敌，一旦发现 染菌立即将种子培养基放弃，并对设备及操作程序作
全面的检查，找出染菌的原因。
5
种子质量的检测与分析
5.1
5.2 5.3
细胞或菌体：菌体形态、菌体浓度以及培养液的
生化指标：种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH 产物生成量：产物生成量是多种抗生素发酵考察
1.2.4 有稳定的生产能力，产物合成持续、稳定、高
产
1.3
种子制备的工艺流程 母斜面活化 摇瓶种
休眠孢子
子或茄子瓶斜面细胞或固体培养基孢子
种子罐 二级种子罐 发酵罐
一级
1.3.1产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种可以用摇瓶 种液，如：用放线菌生产抗生素。 1.3.2对于不产孢子的细菌，生产上一般采用斜面培养， 也可用液体摇瓶的方法。如：用细菌生产谷氨基酸。
1.3.3产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可
以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐 的种子。如：产黄青霉生产青霉素。
2、菌种室种子的制备
2.1 放线菌类孢子的制备
放线菌类孢子的培养温度一般为28 ℃，部分为30 ℃ 或37 ℃，时间一般在4～7天，也有的为14天左右。 一般情况下干燥和限制营养（C：约1%，N含量低于 0.5%）可直接或间接诱导孢子的形成。