第十章动物基因工程

第Ⅰ类限制性酶：每隔一段DNA序列随机切割双链 DNA分子，没有序列特异性 第Ⅱ类限制性酶：能识别一段特异的DNA序列，准确 地酶切双链DNA的特异序列 – 识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向 的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。 这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对 称序列(palindrome)（EcoRⅠ） – 另一类酶，如SmaⅠ，它们酶切DNA双链后，产生 的DNA片段具有平齐末端(blunt ends)
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限制性内切核酸酶 (restriction enzymes)
能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列， 在这一段序列内将双链DNA分子切断。 功能：降解外来DNA分子，以限制(restriction ) 或阻止病毒侵染 是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有 效方式。

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限制性内切酶分类
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限制性酶EcoRI识别位点（粘性末端）
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EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组
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平齐末端（SmaⅠ）
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限制性内切酶的命名
属名＋种名＋菌株类型＋发现的顺序
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限制性内切酶的主要用途
○ 重组DNA分子 · 匹配末端的连接 同一种酶切割不同DNA 分子产生相同的突出末端；或不同酶切割不同 DNA分子产生相同的突出末端，可在连接酶作 用下连接为重组DNA分子。 · 平端连接 可直接连接，但效率较低。 · 不匹配黏端的连接 先补平(Klenow)或 修平(S1)后再连接。 ○ 绘制物理图谱（限制性内切酶图谱）
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基因工程的概念
○基因工程是一种DNA重组技术,在分子水平上进行 遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目 的基因，令其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细 胞，目的基因在细胞中表达获得新的遗传性状 ○基因工程的操作程序：获取目的基因——目的基 因与载体构建重组DNA分子——重组DNA分子转移至受 体细胞——转化细胞的扩增、鉴定和筛选
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二、DNA聚合酶 （一）DNA聚合酶的类型
○ 依赖DNA的——DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅰ大片 段（Klenow）、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰的 T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶。 ○ 不依赖DNA的——末端转移酶 ○ 依赖RNA的——反转录酶
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DNA聚合酶的特性
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一、质粒载体 ○ 质粒是一种存在于细菌细胞质中，独立于细 菌染色体而自然存在的，在细菌体内能进行自我 复制、易分离和导入的DNA环状双链分子 ○ 质粒大小相差很大（从小于1Kb到大于 500Kb），都有一个复制起点。 ○ 亲缘关系密切的两种质粒不能在同一宿主细 胞中稳定地共存，称为质粒的不亲和性。 ○ 只能在特定宿主细胞中复制的称为窄宿主范 围质粒；可以在多种宿主细胞中复制的称为广宿 主范围质粒。
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Berg P、Cohen和Boyer等人的工作是世界上第一次实现DNA 体外重组，建立了第一个基因克隆系统（质粒—大肠杆菌）， 导致了一个全新的生物技术学科和产业——基因工程的诞生。 基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因交 流，在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟 了新的领域、注入了新的方法，为提高人类的生活质量和健康 水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应 用前景
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第二节
一、限制性内切酶
（一）分类与命名
工具酶
○ 酶有几千种，分为6大类：氧化还原酶、转移酶、 水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。 ○ 基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修 饰酶、聚合酶等 水解酶分为内切酶和外切酶 ○ 内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶 从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释 放单核苷酸。
第十章 动物基因工程
现代生物技术（生物工程）的概念
建立在分子遗传学、生物化学、微生物学以及化学工程、 计算技术等基础上的现代生物技术，是20世纪后半叶蓬勃发 展起来的新技术领域，为人类保健、农牧业、食品工业、环 境保护等提供了强大的发展动力。 现代生物技术的内涵非常广泛并不断发展，目前主要有： 基因工程 ·细胞工程 ·蛋白质工程·酶工程 ·糖工程 ·环境生 物工程 ·转基因动物 ·克隆动物 ·基因治疗 ·生物制药·生物 信息学 ·高级生物传感器
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三、DNA连接酶
·该酶的用途是将带匹配黏端的双链DNA或平 端双链DNA片段的5’- P 与另一也带相应缺口的 DNA片段的3′ - OH 连接起来
四、甲基化酶、核酸酶等（从略）
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第三节
基因工程载体
○ 载体是指将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表 达的运载工具 ○ 克隆载体——克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行 繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加 ○ 表达载体——将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达 蛋白质 ○ 插入型载体——将外源基因或DNA插入其中 ○ 置换型载体——切除载体部分DNA，代之以外源基因或 DNA。
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第一节 基因工程概述
一、重组DNA技术的建立
1972年美国斯坦福大学的Berg获得了SV40和λDNA重组 的DNA分子 1973年美国斯坦福大学的Cohen 等人，将大肠杆菌R6-5 质粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌pSC101质粒 DNA（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，产生同 时表现出两种抗性的细菌。 Cohen与Boyer等合作，将非洲爪蟾编码核糖体的基因同 pSC101质粒构成重组DNA分子，并导入大肠杆菌，证实动 物基因进入了细菌细胞，并在细菌细胞中增殖和转录产生相 应的mRNA。
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○ 严谨型质粒——每个细胞中有1-2个拷贝，具有 自身传递能力，分子量大。 ○松弛型质粒——每个细胞中有10-100个拷贝， 不具有自身传递能力，分子量小。基因工程常用 此类质粒。 ○ 常用的质粒有：pBR322、Psc101、ColE1、 Psc134等。 ○ 质粒载体一般能克隆10Kb左右的DNA片段。
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载体必须具备的条件
·能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组 DNA分子 ·载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一 个（置换型载体上被置换片段的两侧各有一个 内切酶位点） ·克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 ·载体上要有报告基因或选择标记基因 ·在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切 酶酶切位点