第七章 发酵工艺控制

三、生物参数
菌浓度和菌形态
菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。 菌形态 显微镜观察
菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌 体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓 基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量 补料量适合与否的一个参数。
发酵过程的代谢控制
发酵过程的代谢控制
发酵过程的代谢控制
发酵过程的代谢控制
4、氨基氮和氨氮
氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是 mg/100ml。如 氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。 氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。 氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。 但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量 铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮 的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。 发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。
发酵过程的代谢控制
CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二 氧化碳的量
CER 呼吸熵＝ RQ OUR
呼吸熵反映了氧的利用状况 RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同， 生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以了 解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料
发酵过程的代谢控制
一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产 物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限 制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率 在较高水平。 对于这种工艺，后期的补料控制是关键。 过程中发现，在补糖开始时，不但CER、OUR 大幅度提高，连RQ也提高约10％，表明通过 补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系 内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提 高，产能增加。
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等 量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。 达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物 浓度，限制性基质浓度都是恒定的。
发酵过程的代谢控制
连续培养的优缺点
优点 控制稀释速率可以使发酵过程最 优化。发酵周期长，得到高的产量。由 于μ＝D，通过改变稀释速率可以比较容 易的研究菌生长的动力学 缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养 会引起菌种退化，降低产量。长时间补料 染菌机会大大增加。
二、发酵类型
• 需氧发酵
– 需氧发酵是由需氧菌在有分子氧存在的条件下 进行的发酵过程。氧在微生物的需氧呼吸中作 为最终的电子受体。这类发酵包括绝大多数的 抗生素、氨基酸以及其他代谢产物的发酵。
• 厌氧发酵
– 厌氧发酵是由厌氧菌或兼性厌氧菌在无分子氧 的条件下进行的发酵过程。包括工业上的乙醇、 丙酮、丁醇、乳酸、丁酸等。
代谢所消耗的基质， 但产物的形成在与 初级代谢分开的次 级代谢中，出现两 个峰，菌体生长进 入稳定期，出现产 物形成高峰。
例如，柠檬酸和某
些氨基酸的发酵。
■
第 三 类 型 （ 非 生 长 关 联 型 ）
产物是在基质消
耗和菌体生长之后， 菌体利用中间代谢 反应来形成的，即 产物的形成和初级 代谢是分开的。 如抗生素发酵。
第一节 工业发酵的主要类型
一 发酵过程的种类
分批培养 补料分批培养
半连续培养
连续培养
发酵过程的代谢控制
1、 分批发酵
简单的过程，培养基中接入菌 种以后，没有物料的加入和取出， 除了空气的通入和排气。整个过程 中菌的浓度、营养成分的浓度和产 物浓度等参数都随时间变化。
发酵过程的代谢控制
分批培养中微生物的生长
发酵过程的代谢控制
随着细胞生长，培养液中的营养物减少， 废物积累，导致细胞生长速率下降，进入 减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大 于生成速率，进入死亡期 对于初级代谢产物，在对数生长期初期 就开始合成并积累，而次级代谢产物则在 对数生长期后期和稳定期大量合成。
发酵过程的代谢控制
分批培养的优缺点
• 粘度 (Pa.s)
– 粘度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志， 也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。通常用表观 粘度表示。它的大小可影响氧传递的阻力，也可反映 相对菌体浓度。
二、 化学参数
目前发酵过程主要分析项目如下 1、pH
pH与微生物的生命活动密切相关—— 酶催化活性 pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映——基 质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状 况
产物量的特殊表示法
1、抗生素效价的表示
抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少， 效价大小用单位（U）来表示 效价表示方法：重量折算法 重量单位
类似重量单位
特殊单位
2、酶活力
酶活力用单位来表示。由于酶通常不是 很纯，不能用重量来表示酶的量。同一种酶 用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容 易造成混乱，为此国际上作了统一规定，规 定在250C下，以最适的底物浓度，最适的缓 冲液离子强度，以及最适的pH诸条件下，每 分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个 活性单位。
• 菌浓测定方法
– 测粘度 – 压缩体积法（离心） – 静臵沉降体积法 – 光密度测定法 OD600~660 适合于细菌、酵 母
生化过程的控制
生化过程的控制
第三节发酵过程中的代谢变化
一、初级代谢产物发酵的代谢变化
二、次级代谢产物发酵的代谢变化
一、初级代谢产物发酵的代谢变化
• 初级代谢指的是生物细胞在生命活动过程中进行 的与菌体的生长、繁殖相关的一类代谢活动，其 产物即为初级代谢产物。
发酵过程的代谢控制
补料分批培养的优缺点
优点 在这样一种系统中可以维持低的基质 浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以 通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条 件；还可以利用计算机控制合理的补料速率， 稳定最佳生产工艺。 缺点 由于没有物料取出，产物的积累最 终导致比生产速率的下降。由于有物料的加 入增加了染菌机会
•
•
• 搅拌功率 (kW)
– 是指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵 液所消耗的功率（它的大小与液相体积氧传递系数有 关。
• 空气流量 (V/V.min)
– 是指每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，它 是需氧发酵中重要的控制参数之一。它的大小与氧的 传递和其他控制参数有关。一般控制在范围内。
发酵过程工艺控制的目的
有一个好的菌种以后要有一个配合 菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能 发挥出来。目标是得到最大的比生产 速率和最大的生产率。
发酵过程的控制
发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如 菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工 程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制 具有不确定性和复杂性。 为了全面的认识发酵过程，本章首先要告 诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上 再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及 进行优化放大。
三、发酵类型
• 生长偶联型
• 部分生长偶联型 • 非生长偶联型
■
第 一 类 型 （ 生 长 关 联 型 ）
产物直接来源于产
能的初级代谢（自 身繁殖所必需的代 谢），菌体生长与 产物形成不分开。
例如单细胞蛋白和
葡萄糖酸的发酵
■
第 二 类 型 （ 部 分 生 长 关 联 型 ）
产物也来源于能量
■生长关联型
产物形成与生长有关， 如酒精、某些酶等。
■非生长关联型 non-growth associated
产物的形成速度 与生长无关，只与 细胞积累量有关。 如，抗生素。
第二节 工业发酵过程的主要 控制参数
发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示 了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个 体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只 能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控 制的眼睛。
这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发 酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧， 尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等
发酵过程控制
代谢参数按性质分可分三类：
物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气 流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳） 浓度等 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、 产物浓度、、核酸量等 生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速 率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等
发酵过程的代谢控制
从检测手段分可分为：直接参数、间接参数
直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数， 如温度、pH、残糖等
间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧 率、KLa等
发酵过程控制
直接参数又可分为: 在线检测参数和离线检测参数
在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到 的参数，如温度、pH、搅拌转速；
发酵过程的代谢控制
3、糖含量
微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。 糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力 菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含 量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节 pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。 糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的 淀粉、饴糖、单糖等各种糖。 还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。
迟滞期
对数生长期
稳
定 期
死亡期
发酵过程的代谢控制
微生物生长分为：迟滞期、对数生长 期、稳定期和死亡期
在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为 当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、 酶等稀释，这时细胞不能分裂。
当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达 到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长 很快，比生长速率几近常数。这个时期称为 对数生长期
发酵工艺控制
发酵过程控制ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ发酵的重要部分 控制难点：过程的不确定性和参数的非线性
同样的菌种，同样的培养基在不同工厂， 不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程 的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水 的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间 的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生 物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的 一般方法对于控制代谢是十分必要的
离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、 菌体浓度。
发酵过程的代谢控制
一、物理参数
• 温度（℃） – 是指整个发酵过程或不同阶段中所维持的温度。它的 高低与发酵过程中酶反应速率、氧在培养液中的溶解 度和传递速率、菌体生长速率和产物合成速率等有密 切关系。 压力（Pa） – 发酵过程中发酵罐维持的压力。罐内维持正压可以防 止外界空气中的杂菌侵在培养液中的溶解度有关，间 入，以保证纯种的培养 。同时罐压的高低还与氧和 在 培养液中的溶解度有关,间接影响菌体的代谢。 搅拌转速（r/min) – 是指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每分钟 的转数来表示。它的大小与氧在发酵液中的传递速率 和发酵液的均匀性有关。
优点 操作简单，周期短，染菌机会 少，生产过程和产品质量容易掌握 缺点 产率低，不适于测定动力学数
据
发酵过程的代谢控制
2、补料分批培养 在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克 服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取 出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时 有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法 很多。
发酵过程的代谢控制
3、半连续培养
在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液 （带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式， 如四环素发酵 优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢 有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。
缺点
代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大
发酵过程的代谢控制
4、连续培养
2、排气氧、排气CO2和呼吸熵
排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后 还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性， 通过计算可以求得摄氧率（OUR）。
排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微 生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入 代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并 不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后 会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。
发酵过程的代谢控制
5、磷含量
微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐 为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。
磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组 成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具 有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。
发酵过程的代谢控制
6、产物浓度
在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况 都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了 生产的状况,是发酵控制的重要参数。而且通过计算还 可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件 如补料、pH对产物形成的影响。