微生物基本试验原理及操作

Hugh-Leifson二氏培养基（OF培养基）成分
பைடு நூலகம்白胨
2g 磷酸氢2钾0.3克 氯化钠 5g 葡萄糖 10g 0.2%溴麝香酚蓝溶液 琼脂 2.5g 蒸馏水 1000ml
12ml
方 法 ： 将 待 检 菌 接 种 于 二 支
Hugh-Leifson培养基的试管中， 均用接种针穿至管底，其中五支 加入灭菌的液体石蜡约1厘米厚。 35，培养48小时观察结果。培养 基颜色变黄即为产酸。
结果：在被检菌接种线与
金黄色葡萄球菌接种线处 出现一个矢状加强溶血区， 为CAMP阳性。阴性无加 强溶血区。
氨基酸和蛋白质代谢试验
吲哚试验 硫化氢试验 苯丙氨酸脱氨酶试验 氨基酸脱羧酶试验（赖氨酸、鸟氨酸、 精氨酸） 脲酶试验 明胶液化试验

吲哚试验
原理：细菌分解蛋白胨中
环腺苷酸（cAMP）试验 原理：B群链球菌（无乳链球菌） 能产生一种因子（cAMP因子）， 这种因子在绵羊血或牛血培养基 上与金黄色葡萄球菌β -溶血素起 协同作用，促进β -溶血素的活性。 因此在两种细菌的交界处溶血力 增加，出现箭头形溶血区。
方法：首先在羊血平板上接种一
长条金黄色葡萄球菌（药敏质控 菌）再将被检菌与金黄色葡萄球 菌接种线垂直接种一短条，两者 不能相交，应相距3mm左右，同 时在被检菌接种线对侧，用同样 方法接种阴性和对照菌，35℃培 养过夜，如放在CO2烛缸内结果 更为好看（金黄色葡萄球菌用 ATCC25923为佳）。
氧化酶试验
血浆凝固酶试验
硝酸盐还原试验 胆汁溶解试验
环腺苷酸（cAMP）试验
过氧化氢酶（触酶）试验
原理：有些细菌具有过
氧化氢酶，能将过氧化 氢酶分解为水。 试剂：3%过氧化氢溶液。
方法：①玻片法：用牙签挑取
18～24小时培养的菌苔，置于 洁净的玻片上，滴加3%过氧化 氢溶液1～2滴。②试管法：取 不含血液的18～24小时培养物 一接种环于试管内，加入1ml 3%过氧化氢溶液。3%过氧化氢 溶液应置于棕色瓶内冷藏。
硝酸盐还原试验培养基成分



蛋白胨 1g 硝酸钾 0.1g 蒸馏水 100ml
方法：将待检菌接种
于硝酸盐培养基中， 35℃培养1-4天，将甲、 乙试剂各加0.1ml于试 管内，混匀观察结果

结果：出现红色为阳性。如无 红色出现，应加少量锌粉，如 仍无红色说明亚硝酸盐进一步 分解成氮、氨等气体，应判为 阳性；如加锌粉出现红色，说 明还原剂锌粉使硝酸盐还原为 亚硝酸盐，待检菌无还原硝酸 盐的能力，为阴性。
试剂：
10%三氯化铁溶液：将 10克三氯化铁溶于100ml 蒸馏水中即成。
方法：将待检菌接种于培
养基斜面上，35培养24小 时，滴加三氯化铁试剂， 观察结果。
结果：培养基斜面上显
绿色为阳性，不变色为 阴性。
氨基酸脱羧酶试验（赖氨酸、 鸟氨酸、精氨酸）
原理：检查细菌使氨基
酸脱去羧基，生成胺类 化合物，使培养基变碱 的能力。
胆汁七叶苷培养基成分






蛋白胨 5g 牛肉浸膏 3g 牛胆汁（胆汁）40g 七叶苷 1g 柠檬酸铁 0.5g 琼脂 15g 蒸馏水 1000ml
结果：培养基变为黑色或
深褐色为阳性。有生长物 时，并不表示七叶苷裂解， 仅表示胆汁浓度不能抑制D 群链球菌外的细菌生长。
各种酶类试验
过氧化氢酶（触酶）试验
葡萄球菌细胞表面含有，游 离凝固酶为金黄色葡萄球菌 产生的一种胞外酶，两酶均 可作用于血浆中的纤维蛋白 原，使其转变为纤维蛋白， 形成凝块。
方法： 玻片法：在玻片上加一滴灭菌生理盐水， 取葡萄球菌18-24小时肉汤培养物一环， 或挑取平板上一个单个菌落制成浓菌悬 液，再加一接种环新鲜人或兔血浆与菌 悬液混匀。同时做阳性菌和阴性菌对照 试验，立刻观察凝块的形成。本试验应 先在生理盐水中乳化，检查有否自凝现 象。防止出现假阳性结果。阳性结果一 般在5-20秒内出现，若3-4分钟后仍无凝 固，可考虑为玻片法试验阴性。
氧化葡萄糖作为唯一碳源， 并具有还原2-酮基葡萄糖酸 盐与班氏试剂混合加热生 成黄红色酮类的能力。
方法：接种大量待检菌于
培养基内，35，24-48小时， 0.5ml培养基加班氏试剂3滴 左右，加热煮沸后观察结 果。
葡萄糖酸盐蛋白胨肉汤成分
蛋白胨
0.15g 酵母浸膏 0.1g 磷酸二氢钾 0.1g 葡萄糖酸钾（或钠）4g 蒸馏水 100ml
微生物基本试验原理及操作
微生物基本试验
碳源和氮源利用试验
碳水化合物的代谢试验 各种酶类试验
氨基酸和蛋白质代谢试验
碳源和氮源利用试验
柠檬酸盐试验
葡萄糖酸盐试验
柠檬酸盐试验
原理：有些细菌能利用柠檬酸盐
作为唯一碳源，分解柠檬酸钠生 成碳酸钠，使培养基呈碱性。能 利用柠檬酸盐作唯一碳源的细菌， 也能利用铵盐作为唯一氮源，铵 盐被分解为氨而产生碱性。
葡萄糖蛋白胨水培养基成分
多价蛋白胨 葡萄糖
7g
5g
磷酸氢二钾
蒸馏水
5g 1000ml
方法：被检菌接种于上 述培养基内，于35℃培 养48小时，于2ml培养液 内加甲基红指示剂2滴， 立即观察结果。
结果：红色为阳性；桔
红色为弱阳性；黄色为 阴性。
VP试验
原理：有些细菌在葡萄糖的代谢过

方法：挑取纯培养物接 种蛋白胨水培养基，于 35℃培养1-2天，沿管壁 徐 徐 加 入 kovac 氏 试 剂 0.5ml，使成两层，观察 结果。
结果：在两者液面交界
处出现红色为阳性，无 色为阴性。
硫化氢试验
原理：细菌分解培养基中的含
硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨 酸）和含硫化物生成硫化氢， 硫化氢遇铅或铁离子生成黑色 的硫化物。由此间接地检测细 菌是否产生硫化氢。
西蒙氏柠檬酸盐培养基成分

MgSO4-7H2O 0.2g NH4H2PO4 1g K2HPO4 1g 柠檬酸钠 5g 氯化钠 5g 琼脂 20g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40ml 蒸馏水 1000ml
结果：阳性者表面上 长有菌落，培养基 变为蓝色。
葡萄糖酸盐试验
原理：检查细菌是否具有
B—半乳糖苷酶试验（ONPG 试验）
原理：有的细菌可产生B-半乳糖
苷酶，此酶可分解邻-硝基酚-BD- 半 乳 糖 苷 （ ONPG）。ONPG 为无色，经B-半乳糖苷酶水解后， 可产生黄色的邻硝基酚，即使浓 度很低也能检出。
结果
呈现黄色为阳性反应。迅速
及迟缓分解乳糖的细菌ONPG 试验为阳性，本试验可作为 迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴 定方法。
胆汁溶解试验

原理：在特定时间和温度 条件下测定胆盐溶解细菌 的能力。溶菌的机理尚未 定论，有人认为胆盐或胆 汁能激活肺炎链球菌的自 溶酶，使菌体发生溶解。
试剂：10%去氧胆酸
钠溶液或牛胆汁
平板法：10%去氧胆酸钠
溶液一接种环，加于血琼 脂平板的试验菌落上，置 于35孵育30分钟，肺炎链 球菌菌落消失为阳性。阴 性者菌落仍存在。
结果
代谢类型 发酵型 氧化型 产碱型


加蜡封口管 开放管 产 酸 产 酸 不变色 产 酸 不变色 不变色
糖醇发酵试验
原理：各种细菌因含有发酵不同
糖、醇类的酶，所以分解糖、醇 类的能力各不相同。分解糖、醇 类后产生的代谢产物可因菌种不 同而异，有的产酸、产气，有的 仅产酸，故用于鉴别细菌。
程中生成丙酮酸，丙酮酸进一步脱 羧后可产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲 基甲醇在碱性溶液中被空气的氧氧 化为二乙酰（丁二酮），进而与培 养基内蛋白胨中的精氨酸所含的胍 基发生反应，生成红色化合物，即 VP反应阳性。培养基中的胍基太少 时，加入少量含胍基的化合物，如 肌酸或肌酸酐等，可加速此反应。
试剂：甲液：6%a-萘酚乙醇溶液 乙液：40%氢氧化钾溶液
结果：产生大量气泡为
阳性，不产生气泡为阴 性。
血浆凝固酶试验
原理：凝固酶能凝固血浆纤维蛋
白，是鉴定金黄色葡萄球菌的主 要试验。本试验分玻片法和试管 法，玻片法主要是检测结合凝固 酶，试管法是为了肯定玻片法试 验结果和对玻片法试验阴性者进 行复查，检测游离凝固酶。
血浆凝固酶试验
原理：结合凝固酶为金黄色
氧化酶试验 原理：某些细菌具有氧化酶， 在有氧和细胞色素C时，使还原 型细胞色素C氧化，氧化型细胞 色素C再使二甲基对苯二胺氧化， 产生玫瑰红至暗紫色。有时菌落 本身带有红色，不易观察，可再 加入a-萘酚乙醇溶液，使生成深 蓝色的靛酚蓝。
试剂： 1． 1%盐酸二甲基对苯二胺 （或四甲对苯二胺）水溶液 2． 1%a-萘酚95%乙醇溶液
的色氨酸，生成吲哚（靛 基质），经与试剂 中的对 二甲氨基苯甲醛作用，生 成玫瑰吲哚而呈红色。
蛋白胨水培养基成分
蛋白胨（或胰胨）10-20g 氯化钠 蒸馏水
5g 1000ml
kovac氏试剂 对二甲氨基苯甲醛 10g 纯戊醇 150ml 纯浓盐酸 50ml 先将试剂溶于醇中，缓慢 加入盐酸即成。
试管法：将洁净小试管中加0.5ml未稀释
的人或兔血浆，加0.5ml培养18-24小时 的葡萄球菌肉汤培养物一满环，或挑取 平板上的纯菌落，轻轻转动（不要摇动） 试管混匀。放35水浴中4小时，每隔30分 钟检查一次有无凝固。检查时不要振动 或摇动试管，可轻轻将试管倾斜以观察 有无凝块。大多数金黄色葡萄球株在 35℃4小时可以凝固血浆，如果阴性对照。 枸椽酸盐抗凝的血浆可产生假阳性结果。


方法：取18-28小时的新 鲜培养物，用无菌滤纸条， 蘸取菌落少许，滴加1%盐 酸二甲基对苯二胺1-2滴， 观察结果。

结果：一分钟内出现紫红 色为阳性。若菌落本身有 色素，则再滴加a-奈酚1-2 滴，出现蓝色则为阳性。