生物技术大实验完整版

生命的基本特征：①细胞是生物的基本组成单位（病毒除外）②新陈代谢、生长和运动是生命的基本功能③生命通过繁殖而延续，DNA是生物遗传的基本物质④生物对外界可产生应激反应和自我调节，对环境具有适应性

生物学经历的三个阶段：描述生物学阶段、实验~、创造~

生物技术：也称生物工程，是以现代化生命科学为基础，运用先进科学原理和工程技术手段按预先的设计来加工或改造生物材料，从而产生出人类需要的产品或达到某种目的

生物技术发展三个阶段：作坊式生物技术、工业化~、现代~

生物技术内容：基因工程技术、细胞~、酶~、发酵~、蛋白质~

细胞工程：指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术

蛋白质工程：是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。蛋白质工程也成为“第二代基因工程”

生物技术基本特征：①高效益②高智力③高投入④高竞争⑤高风险⑥高势能

透光度t：某一波长的光透过某一物质的溶液时，其入射的角度I0与透过溶液后的强度I相比发生了变化：I与I0的比值（I /I 0)称为透光度

实验室常用水的制备：①利息交换法②蒸馏法③反浸法④超纯法

消毒灭菌方法：①高压高温灭菌②干热灭菌③滤膜灭菌④化学消毒法⑤紫外线灭菌⑥抗生素灭菌消毒

核酸的一级结构：线性结构，核苷酸的排列顺序，也称碱基序列

二级结构：双螺旋结构

三级结构：超螺旋结构

DNA的变形：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程

增色效应：核酸变性后，在260nm处吸收值上升

DNA的复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象

减色效应：DNA复性时，OD260值下降

影响复性速度的因素：①溶液温度的高低②单链片段的大小③单链片段浓度④溶液离子强度的大小⑤片段内重复序列的多少

OD260的应用：OD260=1.0 相当于①50ug/ml 双链DNA ②40ug/ml 单链DNA或RNA③20 ug/ml 寡核苷酸

基因（分子生物学概念）：基因是DNA双螺旋分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列管家基因：某些基因是维持细胞基本代谢所必须的基因，其在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达

阅读框架：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码子为止的一个连续编码序列

基因的结构：外显子、内含子、前导区、尾部区、调控区

三个关键因素：①自由复制的DNA序列②着丝粒DNA序列③端粒DNA序列

原核生物和真核生物染色体的区别：①原核生物的染色体实质上是一个裸露的DNA双螺旋结构，DNA通常呈环状，且与相对少量的蛋白质结合，长度可打达几厘米，DNA复制从单一复制起点开始②真核生物都有许多线状的染色体，且染色体存在于细胞核内，真核生物染色体由DNA、组蛋白、RNA、非组蛋白等成分组成。这些蛋白具有功能或结构方面的作用。染色体DNA的数量远比原核生物多。每条染色体有多个复制起点

分离纯化核酸的总原则：①保证核酸的一级结构完整性②防止核酸的生物降解③排除其他分子的污染

真核细胞DNA制备实验基本原理：要从组织中提取DNA就必须先将组织分散成单个细胞，

然后破碎包膜及核膜，使染色体释放出来，同时还要除去与DNA结合的组蛋白及非组蛋白质粒按复制方式分：松弛型质粒、严密性质粒

质粒特性：①分子相对小②含高效的自主复制成分③不相容性④转移性⑤选择的标记⑥限制性内切酶单一切口

碱裂解法原理：在PH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭合环质粒DNA人为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA 之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，儿质粒DNA 仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。质粒尚在上清中，在用酚氯法抽提进一步纯化质粒DNA

电泳：是指带电粒子在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。

影响电泳迁移率的因素：1，样品：即颗粒所带净电荷的数量、大小及形状。2，支持介质：惰性材料有一定坚韧度，吸附力小，无电渗作用。

吸附作用：是介质对样品颗粒的吸附作用，所以出现拖尾和条带不均匀，纸最大，醋酸纤维素介质最小，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶居中。

电渗：在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动为电渗。其产生原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基因，因此吸附溶液中的正离子和负离子，使溶液

分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现不同的迁移率，这就是分子筛效应。

影响凝胶电泳的因素：1DNA分子的大小2琼脂糖的浓度3DNA分子的构象 4 电源电压5嵌入燃料的存在6离子强度的影响

聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点：1、在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。2、化学性能稳定，与初分离物不起化学反应在很多溶剂中不溶。3、对PH和温度变化较稳定。

4、几乎无吸附和电渗作用。

5、样品不易扩散，用量少。其灵敏度可达10-6

6、凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。

7、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中集浓缩，分筛和电荷效应为一体。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理：当向蛋白质溶液中加入足量SDS，可引起构象改变，蛋白质—SDS形成的复合物近似“雪茄烟“形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于分子量大小，所以它们以相等的迁移率速度从浓缩胶进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而别分离。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤：1、胶膜固定2、制备分离胶3、制备浓缩胶4、准备电泳5、上样6、电泳7、染色8、脱色9、观察结果

第六章

限制性核酸内切酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。

细菌限制性内切酶的修饰机理：各种细菌都可以合成一种或几种切割顺序专一的DNA内切酶，，这种酶的主要功能是对外源性的双链DNA进行切割、水解不允许外源性DNA存在细菌自身细胞内，而自身的DNA可以不受酶的切割因为细菌细胞还合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核苷酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解，这就是限制性内切酶修饰系统。

限制性内切酶分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型

Ⅱ型特点：①限制性内切酶修饰系统是由两种酶分子组成的，一种为限制性内切酶另一种为独立的早基化酶，其修饰作用是与限制性内切酶识别位点相重叠的序列。