无选择标记转基因植物研究进展

无选择标记转基因植物研究进展

张洁,郑文永,王冬梅3

　(河北农业大学生命科学学院,河北保定071001)

摘要　综述了近年来国内外在植物无选择标记转基因技术方面的发展和研究成果,包括共转化法、转座子法(Ac/Ds 转座子系统)、位点特异性重组系统法(F LP/FRT 、Cre/LoxP 、R/RS )等。关键词　无选择标记;转基因植物;位点特异性重组;共转化中图分类号　S188 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2009)12-05390-03P rogress in M arker 2free T ransgenic P lants

ZH ANG Jie et al (T he C ollege of Life Science ,Agriculture University of H ebei ,Baoding ,H ebei 071001)Abstract S om e techn ology and research results ab out m arker 2free transgenic plant were summ arized ,including co 2trans form ation ,transpos on system (Ac/Ds ),site 2specific recombination system (F LP/FRT ,Cre/LoxP ,R/RS )et.K ey w ords M arker 2free ;T ransgenic plants ;S ite 2specific recombination ;C o 2trans form ation

基金项目　河北省科技攻关计划项目(042401116D 21);河北省教育厅

项目(2008460);河北农业大学科研发展基金资助。

作者简介　张洁(1974-),女,河北冀州人,讲师,从事植物遗传转化

方面的研究工作。3通讯作者。

收稿日期　2009201222

近年来,随着商品化转基因作物的不断出现,人们对遗传工程生物的环境安全和食品安全问题的关注越来越多。在植物基因转移过程中,一般都使用选择性标记基因来鉴定外源目的基因是否导入植物体。然而,当获得了真正的转基因植株后,选择标记基因就失去了存在的价值,其继续表达的产物也会对环境及植物体的生长发育产生不良影响,从而对人类自身及生存环境和生态平衡造成潜在的威胁。如对于抗生素类选择标记基因的应用,人们最担心的是,这类基因的使用有可能被转移到微生物中,如果增加了这些微生物在人或动物消化道内的数量,这将危及抗生素在临床及兽医上的应用。再如对除草剂抗性基因的使用,如果这类基因流动到危害粮食作物生长的杂草中就会使其获得抗除草剂性能,而成为现有除草剂无法将其杀死的“超级杂草”[1]

。目前关于选择标记基因对健康和环境的影响问题尚无定论,直接影响了转基因植物在市场中的投入

[2]

。另外,在对转基因植

物进行二次或多次转化时,每一次转基因的插入都需要进行转化筛选,但可用于植物转基因筛选的标记基因非常有限,难以满足再转化时对多个标记基因的要求[3]。所以,人们期望建立一个可操作系统去除选择标记基因,以便通过重复转化来增加转基因的数目[4]。尽管安全性评估部门已报道,使

用新霉素磷酸转移酶(NPT Ⅱ

)作为选择标记基因不存在健康或安全方面的问题[5],然而要对其他每一个选择标记基因及其产物进行安全性评价,将耗费大量人力、物力、财力及时间,影响转基因植物投入市场。因此,如何去掉转基因植物体内的筛选标记,培育不带选择标记基因的转基因植物

(marker 2free transgenic plants ,MFTPs )已成为当前植物基因工

程研究的迫切需要。笔者就当前国内外在植物无选择标记转基因技术方面的研究进展作一概述。

1　获得MFTPs 的方法

构建无选择标记基因的遗传转化系统是获得生物安全的转基因植物的有效途径。目前构建无选择标记基因的转基因系统的方法主要有:共转化系统(C o 2trans formation )、转座

子系统(T ransposable element )、位点特异性重组系统(S ite 2spe 2

cific recombination system )、不可逆重组系统(irreversible recom 2bination system )等。

1.1　共转化法　共转化是将标记基因和目的基因分别构建

在不同载体或同一载体的不同区域,共同转化受体细胞,通过筛选和分子鉴定获得共整合植株,在后代分离中选择只含有目的基因而不含有标记基因的转化植株。这主要是由于两个基因不可能完全位于同一个整合位点,因此转基因植株在其后的自交过程中,目的基因和标记基因会发生分离和重组,通过有目的筛选鉴定,可获得只含目的基因而不带抗性标记基因的转化植株,从而达到去除标记基因的目的。这个系统要求共转化频率高,且共转化的DNA 在受体细胞中处于不连锁状态,才可以满足剔除标记的需要。De Block 等[6]用两个农杆菌转化油菜,共转化率达60%～80%。M cK night 等[7]在烟草的转化中用两个分别带有不同基因的农杆菌进行转化,对后代进行筛选获得了只带有一个基因的转化体。刘峰等[8]利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的水稻植株。在实际应用中,由于不同转化质粒载体中的转基因共整合频率偏低,且常整合在受体基因组的同一位点上,使共转化系统的应用受到了限制。为了提高共转化效率,不同的研究者对共转化方法进行了改进[9-13]。目前一般认为,双T 2DNA 载体方法比混和菌株方法的共转化率高得多。在双T 2DNA 的策略中,K omari 等[9]进行的T i 质粒的构建需要在农杆菌内同源重组后才能完成,且质粒非常大,不利于基因克隆;X ing 等[10]、Breitler 等[11]构建的质粒无需同源重组,质粒较小,且操作简便,便于基因克隆,是较好的方法。Lu 等[12]将标记基因与关注基因设计在带双右边界序列(d ouble right 2b order ,

DR B )的T 2DNA 单元中,由于少了一个左侧边界,质粒更小,

便于基因克隆,获得了带水稻齿裂矮缩病毒基因组中第5个基因片段S5的无选择标记转基因水稻,且效率很高。2006年,张秀春等[13]用双T 2DNA 法获得了9株只含有功能基因

(△62脂肪酸脱氢酶基因,D 6D )而不含有筛选标记基因

(BAR )的转基因大豆,使T 2DNA 载体方法在转化频率相对较

低的大豆转化体系中得以成功应用。

1.2　转座子法　转座子成分能够利用保守的切割粘连机

制,从植物染色体中的某个位置转移到新的遗传座位。利用

安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(12):5390-5392,5405 责任编辑　李占东　责任校对　况玲玲