细胞培养及抗肿瘤药物筛选

细胞培养及抗肿瘤药物筛选

博哥

(中山大学化学与化学工程学院，广州510275)

一引言

随着分子生物学和细胞生物学的崛起，为了在活细胞中研究生命现象，细胞培养方法得到了广泛的发展和应用。细胞培养的突出优点，是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响。因为人工培养条件易于改变，并能得到严格的控制，有利于单因子分析。另外，细胞培养还便于我们对细胞生长、发育过程的观察，可以用显微镜直接观察亦可应用显微缩时电影技术记录其进程。因而，细胞培养是探索和解释细胞生命活动规律的一种简而易行的技术。然而，细胞培养方法也有其局限性，由于培养的细胞生活在脱离了机体的复杂的环境条件下，其生态环境和细胞之间的相互关系都改变了，因此，其细胞生物学性质必然也会发生某些改变。所以在人工培养条件下观察到的结果难于正确反映细胞或组织在机体内部的状况。这一点是我们在应用此技术进行研究时应该注意的。

本实验采用的培养基由合成培养基、小牛血清配和双抗制而成。实验对Hela细胞进行了复苏、传代培养、观察不同状态下的Hela细胞，并用MTT法测定8种药物的抗癌作用。

二、实验原理

1．培养基的配制

组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、粘附因子等，这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10％-20％)。在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用(双抗)。培养液内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。

2．细胞的冻存与复苏

细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反。结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

3．细胞传代培养(消化法)

传代培养是组织培养常规保种方法之，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。贴壁生长细胞采用酶消化法传代，常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

4．噻唑蓝实验方法(MTT法)测定药物的抗癌作用

四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide〕是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臢(fomazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚砜溶解甲臢后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。

三、仪器试剂

1. 仪器与材料

CO2培养箱，倒置显微镜，培养瓶，血球计数板，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞。

2．试剂

无离子水，小牛血清，合成培养基(RPMI1640)，青霉素，链霉素，NaHCO3、0.25％胰蛋白酶，PBS溶液或Hanks液。

四、操作步骤

1．培养基的配制

合成培养基有商品出售，使用加入时适量小牛血清和抗生素。

2．复苏

从液氮(－196 ℃)中取出冻存管，迅速投入37 ℃水浴中，使其融化(1 min左右)。5 min内用培养液稀释至原体积的10倍以上，低速离心10 min，去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

3．消化与传代

(1)倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用溶液37 ℃下预热。

(2)打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。

(3)点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后摆在无菌试管内。

(4)将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

(5)倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3 ml PBS溶液或Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

(6)每个大培养瓶加入1 ml胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶例掉。注意勿使细胞提早脱落人消化液中。

(7)加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

4．细胞计数

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

(1)将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

(2)将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

(3)静置3 min。

(4)镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000

5．MTT法测定药物的抗癌作用

(1)选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640培养