基因功能分析的基本策略.pptx
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基因功能分析的基本策略
它旨在揭示基因如何参与生命活动， 以及基因变异如何影响生物体的性状 和疾病易感性。
基因功能分析的重要性
基因功能分析是理解生物学过程和疾病机制的关键，有助于发现新的治疗靶点和发展个性化医疗策略。
通过基因功能分析，可以深入了解基因与表型之间的关系，为遗传性疾病和复杂性疾病的预防、诊断 和治疗提供科学依据。
详细描述：基因变异与药物反应关联分析旨在了解不同基因变异对药物 疗效和副作用的影响。这种分析有助于实现个性化用药，提高治疗效果
并减少副作用。
通过以上三种策略，基因功能分析有助于深入了解基因与疾病的关系， 为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
基因功能研究的挑战与展望
基因功能研究的挑 战
技术限制
目前的技术手段在研究基因功能时仍存在局限性，例如难以对所有 基因进行全面研究，难以精确分析基因间的相互作用。
04
数据处理与分析
对收集到的数据进行处理、统计分析 和可视化，挖掘基因功能相关的模式 和规律。
基因表达分析
基因表达的检测方法
基因芯片技术
通过微阵列芯片检测基因 表达谱，可同时检测大量 基因的表达水平。
测序技术
利用高通量测序技术，对 特定组织或细胞中的基因 表达进行全面检测。
荧光定量PCR
通过荧光染料或探针，实 时监测PCR扩增过程中荧 光信号的变化，从而确定 基因表达量。
跨学科合作 基因功能研究需要多学科的交叉合作，包括生物 学、医学、化学、物理学等，以更全面地理解基 因的功能。
个性化医疗 随着基因功能研究的深入，将有助于实现基于个 体基因信息的个性化医疗，提高疾病预防和治疗 效果。
未来研究方向
深入研究基因间的相互作用
未来研究将更深入地探索基因间的相互作用， 以更准确地理解基因的功能。
基因功能分析的重要性
基因功能分析是理解生物学过程和疾病机制的关键，有助于发现新的治疗靶点和发展个性化医疗策略。
通过基因功能分析，可以深入了解基因与表型之间的关系，为遗传性疾病和复杂性疾病的预防、诊断 和治疗提供科学依据。
详细描述：基因变异与药物反应关联分析旨在了解不同基因变异对药物 疗效和副作用的影响。这种分析有助于实现个性化用药，提高治疗效果
并减少副作用。
通过以上三种策略，基因功能分析有助于深入了解基因与疾病的关系， 为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
基因功能研究的挑战与展望
基因功能研究的挑 战
技术限制
目前的技术手段在研究基因功能时仍存在局限性，例如难以对所有 基因进行全面研究，难以精确分析基因间的相互作用。
04
数据处理与分析
对收集到的数据进行处理、统计分析 和可视化，挖掘基因功能相关的模式 和规律。
基因表达分析
基因表达的检测方法
基因芯片技术
通过微阵列芯片检测基因 表达谱，可同时检测大量 基因的表达水平。
测序技术
利用高通量测序技术，对 特定组织或细胞中的基因 表达进行全面检测。
荧光定量PCR
通过荧光染料或探针，实 时监测PCR扩增过程中荧 光信号的变化，从而确定 基因表达量。
跨学科合作 基因功能研究需要多学科的交叉合作，包括生物 学、医学、化学、物理学等，以更全面地理解基 因的功能。
个性化医疗 随着基因功能研究的深入，将有助于实现基于个 体基因信息的个性化医疗，提高疾病预防和治疗 效果。
未来研究方向
深入研究基因间的相互作用
未来研究将更深入地探索基因间的相互作用， 以更准确地理解基因的功能。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
超好研究生分子生物学课件-第九章 基因和基因功能分析基本策略07
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目录
18
3.RNA酶保护实验 酶保护实验
基因转录后的RNA剪接可 剪接可以直接影响基因活性 使一个基因产生多条多肽链或蛋白质产物。 使一个基因产生多条多肽链或蛋白质产物。RNA 酶保护实验(RNase protection assay, PRA)是一种 酶保护实验 是一种 液相RNA杂交技术，主要是用 杂交技术， 液相 杂交技术 主要是用RNase A 和RNase T1专一性降解单链 专一性降解单链RNA，分析受保护的杂交双链 专一性降解单链 ， RNA，从而确定 确定RNA是否剪接、剪接种类、剪接 是否剪接、 ，从而确定 是否剪接 剪接种类、 位点及内含子的可能位置等。 位点及内含子的可能位置等。 PRA的基本程序主 的基本程序主 要包括待测RNA的分离、 RNA探针的制备、待测 的分离、 探针的制备、 要包括待测 的分离 探针的制备 RNA与RNA探针的液相杂交和 与 探针的液相杂交和RNA酶消化等。 酶消化等。 探针的液相杂交和 酶消化等
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目录
8
DNA自动测序结果举例
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目录
目录 9
2. 基因拷贝数变化的分析方法
用Souther blot分析基因拷贝数 分析基因拷贝数
此法通常只能分析已知基因的拷贝数.其成功与否的关 此法通常只能分析已知基因的拷贝数 其成功与否的关 键在于适当的DNA酶切消化和基因探针的标记 酶切消化和基因探针的标记. 键在于适当的 酶切消化和基因探针的标记
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目录
10
Southern blot 的基本过程
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目录
11
Northern blot 的基本过程
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《基因功能分析》课件
通过荧光染料或探针标记的特异引 物，对特定基因进行实时荧光检测 ，实现对基因表达的定量分析。
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
基因功能分析的基本策略-硕士
化学合成
质量高，高纯度，高成本 适用于已经验证过抑制效率的靶点序列 不适于筛选靶点序列
体外转录
成本适中，省时，适用于筛选靶点序列 不适用于长期的研究或者针对某个特定靶 点序列的大量研究
长片断dsRNA酶解法
dsRNA在体外被RnaseⅢ家族 成员切割成siRNA 不需要验证筛选多个靶点序列 不适用于长期研究或者特定 siRNA序列的研究
Embryonic Stem Cells
同源重组
5´ 3´ 3´ 5´
5´ 3´
5´ 3´
3´ 5´
5´
3´
3´ 5´
target
targeting vector
TK
homologous recombination
5´ 3´
“knockout”
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
AAACCAGCAGAACGTGTACGA
载体介导的细胞内表达siRNA 方法的特点
操作简便，稳定性好 siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于 研究 适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选 标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷的细胞株
目的基因mRNA获取：
1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）
2、/ 3、其它网站
载体构建：
dsDNA形成：退火 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定
转染：瓶颈之一
含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志
效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾
RNA
translation
Protein
分子生物学C11基因分析的基本的策略-PPT课件
（二）揭示基因和基因组一级结构 变化在医学研究中具有重要意义
• 揭示基因和基因组一级结构变化是推动医 学研究纵深发展的关键 • 通过对基因组遗传语言的破译，揭示基因 结构与功能的关系 • 比较基因组学就是在基因组一级结构的基 础上，通过比较发现新基因或基因新功能 的过程
(三) 通过DNA序列分析可以鉴定基 因和基因组的变异
第十一章
基因分析的基本策略
• 基因操作——所有涉及到DNA或者RNA 操作的技术，或者指所有基因工程和 基因工程相关技术 • 基因分析 • 基因功能的研究
基因分析的构思
• 了解基因的组成——基因的DNA序列测定 • 了解基因在染色体的位置——原位杂交 • 了解基因在基因组上的拷贝数—— Southern Blot • 了解基因表达水平——Northern Blot、RT －real time PCR • 了解基因表达产物的水平——Western Blot
第一节
利用DNA定性定量分析可从不同角度 对基因和基因组进行研究
（一）DNA 序列测定可以揭示基因 和基因组一级结构变化
• 两种DNA序列测定基本技术具有不同的原 理和特点 – 双脱氧链末端终止法(diddeoxy chain termination)或Sanger 法 – 化学裂解法或（Maxam-Gil-bert 法）
• 当靶DNA与标记探针形成G-T或G-A末端碱基错配的 双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短， 碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与完全 的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交产物 的总体稳定性下降，信/噪比下降，影响结果的可 靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用于测 定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。 • SBH的应用： ① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变； ② 可用于不同DNA片段之间的序列比较； ③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基 因的表达状况； ④ 可用于检验传统测序技术的准确性。
新版基因功能分析的基本策略
二、基本原理
构建携带目旳基因旳载体。 外源基因导入：将目旳基因经过显微注射等 措施注入试验动物旳受精卵或着床前旳胚胎 细胞中。 使目旳基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前旳胚胎细胞再植入受体 动物旳输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因旳转基因动物。
基本原理
供体基因
受体旳受精卵
基本原理
▪ 基因敲除(gene knockout): 将某个基因定向
清除。
▪ 基因敲入(gene knockin): 定向将一段基因
序列替代另一段基因序列。
一、基因打靶旳基本程序
打靶载体旳构建。 打靶载体导入 ES 细胞及其鉴定。 基因敲除 ES 细胞注射入胚泡。 胚泡植入假孕小鼠旳子宫。 嵌合体旳杂交建立基因打靶旳纯合鼠系。
1998 年，Fire 等在 C. elegans 中用 antisense RNA 克制基因体现。
ds RNA 比 sense 或 antisense RNA 都好。 注射甚至口服 dsRNA 都能诱发基因沉默。 极少许旳双链 RNA 就能诱发 C. elegans 整 体旳基因沉默，甚至能传递到子一代。 RNA 干扰：RNA interference (RNAi)
取得病毒颗粒感染早期胚胎 包装细胞与早期胚胎共培养
感染后旳胚胎植入受体动物子宫，发育
成携带外源基因旳动物。
逆转录病毒感染法
外源基因 逆转录病毒载体
四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 逆转录病毒感染 纯合体小鼠 嵌合小鼠
逆转录病毒感染法旳特点
经过病毒 DNA 插入宿主 DNA 旳机制，将 外源目旳基因整合到宿主基因组，整合效率 高。
胚胎干细胞外源 DNA 旳导入
DNA
磷酸钙-DNA 共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法
分子生物学C11基因分析的基本策略54页PPT
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
分子生物学C11基因分析ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基本策略
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
分子生物学C11基因分析ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基本策略
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
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转入的外源基因要能够高效表达，最好是 可以诱导表达。 转入基因中应该包含有帮助提高整合效率 的序列，如微卫星序列。
微卫星序列 诱导表达 启动子
外源基因
微卫星序列
2) 胚胎干细胞法
胚胎干细胞(embryo stem cells, ES 细胞)： 可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细 胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡 期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他 类型细胞的能力。
二、基本原理
构建携带目的基因的载体。 外源基因导入：将目的基因通过显微注射等 方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎 细胞中。 使目的基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体 动物的输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因的转基因动物。
基本原理
供体基因
受体的受精卵
基本原理
▪ 基因导入技术：物理、化学和生物学方法
1) 显微注射法 （microinjection) 2) 胚胎干细胞法（embryonic stem cells, ES 细胞） 3) 逆转录病毒感染法 4) 精子载体法
1) DNA显微注射法
制备超量受精卵。 DNA 显微注射。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
▪ 定点整合位点必须在基因组的可以进行转
录的地方。
胚胎干细胞法的特点
▪ 定点整合。 ▪ ES 细胞在体外培养，外源 DNA 导入后可
用正-负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞, 相对较简单。
▪ 目前只在小鼠身上获得成功。
3）逆转录病毒感染法
逆转录病毒载体的构建
获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 外源 DNA 导入早期胚胎：
基因转移鼠纯合鼠系的建立
生殖系细胞中不
×
含转入基因
生殖系细胞中含 转入基因
转基因杂合鼠 未转基因鼠
ES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和 分化特性。
胚胎干细胞法
分离和培养 ES 细胞。 外源基因导入 ES 细胞。 导入外源基因的 ES 细胞的子宫转移。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
胚胎干细胞的分离和培养
胚泡
培养皿中分离 胚泡内层细胞
胚胎干细胞 加饲养层细胞培养
胰蛋白酶 消化解离
胚胎干细胞的分离和培养
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
▪ 融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。
基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。
基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。
细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
一.转基因生物的意义
20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基 因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。
转基因生物的用途： 研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。
转基因的受精卵
基本原理
转基因动物
基本过程
▪ 上游—基因改造和载体构建 ▪ 中游—基因转移、胚胎移植与建系 ▪ 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
▪ 外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
▪ 报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中毒感染 DNA
3. 下游—基因整合与表达检测及筛选
▪ 染色体基因水平：是否整合了外源基因以
及整合的位点和拷贝数。
▪ 转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以
及表达水平。
▪ 蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功
能检测。
鉴定方法
▪ PCR ▪ Southern blot ▪ 染色体原位杂交 ▪ Northern blot ▪ RT-PCR ▪ Western blot
获得病毒颗粒感染早期胚胎 包装细胞与早期胚胎共培养
感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育
成携带外源基因的动物。
逆转录病毒感染法
外源基因 逆转录病毒载体
四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 逆转录病毒感染 纯合体小鼠 嵌合小鼠
逆转录病毒感染法的特点
通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将 外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率 高。
胚胎干细胞外源 DNA 的导入
DNA
磷酸钙-DNA 共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法
胚胎干细胞
囊胚
微注射
原囊胚
转基因动物
外源 DNA 的整合
▪ 用于 ES 细胞的 DNA 载体一般带有定点整
合元件, 避免了随机整合。
▪ 定点整合位点应选择在基因组内编码非必
需产物的地方，以减少整合对细胞正常功 能的影响。
DNA 显微注射
DNA注射针
持卵管
精原核 卵原核
DNA 显微注射
DNA 显微注射到尚未发生核融合的受精卵 的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原 核大，容易辨别。
线性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出数 倍，因而用于显微注射的转入基因通常是 去除载体序列的线状 DNA。
DNA 显微注射法的特点
反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段 DNA(＜10kb)。
对家禽类的转基因研究有重要意义。
4）精子载体法
外源 DNA 共育法 脂质体转染法 电穿孔法
精子 卵细胞
受精卵
转基因动物
DNA
精子 卵细胞
DNA 磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法
胚胎干细胞
受精卵
四细胞 胚胎
微注射 囊胚 原肠胚
▪ DNA 大小无限制，最大可达 250Kb。 ▪ 随机整合：在染色体上整合的位点是随
机的，整合的拷贝数也不一定。
▪ 转入的基因有可能碰巧整合到具有重
要功能的基因之中，干扰该基因的正 常表达，影响转基因动物的正常发育 和代谢。
▪ 总效率较低(实际成功率1/1000)。
提高显微注射 DNA 表达的成功率
微卫星序列 诱导表达 启动子
外源基因
微卫星序列
2) 胚胎干细胞法
胚胎干细胞(embryo stem cells, ES 细胞)： 可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细 胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡 期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他 类型细胞的能力。
二、基本原理
构建携带目的基因的载体。 外源基因导入：将目的基因通过显微注射等 方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎 细胞中。 使目的基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体 动物的输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因的转基因动物。
基本原理
供体基因
受体的受精卵
基本原理
▪ 基因导入技术：物理、化学和生物学方法
1) 显微注射法 （microinjection) 2) 胚胎干细胞法（embryonic stem cells, ES 细胞） 3) 逆转录病毒感染法 4) 精子载体法
1) DNA显微注射法
制备超量受精卵。 DNA 显微注射。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
▪ 定点整合位点必须在基因组的可以进行转
录的地方。
胚胎干细胞法的特点
▪ 定点整合。 ▪ ES 细胞在体外培养，外源 DNA 导入后可
用正-负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞, 相对较简单。
▪ 目前只在小鼠身上获得成功。
3）逆转录病毒感染法
逆转录病毒载体的构建
获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 外源 DNA 导入早期胚胎：
基因转移鼠纯合鼠系的建立
生殖系细胞中不
×
含转入基因
生殖系细胞中含 转入基因
转基因杂合鼠 未转基因鼠
ES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和 分化特性。
胚胎干细胞法
分离和培养 ES 细胞。 外源基因导入 ES 细胞。 导入外源基因的 ES 细胞的子宫转移。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
胚胎干细胞的分离和培养
胚泡
培养皿中分离 胚泡内层细胞
胚胎干细胞 加饲养层细胞培养
胰蛋白酶 消化解离
胚胎干细胞的分离和培养
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
▪ 融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。
基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。
基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。
细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
一.转基因生物的意义
20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基 因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。
转基因生物的用途： 研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。
转基因的受精卵
基本原理
转基因动物
基本过程
▪ 上游—基因改造和载体构建 ▪ 中游—基因转移、胚胎移植与建系 ▪ 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
▪ 外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
▪ 报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中毒感染 DNA
3. 下游—基因整合与表达检测及筛选
▪ 染色体基因水平：是否整合了外源基因以
及整合的位点和拷贝数。
▪ 转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以
及表达水平。
▪ 蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功
能检测。
鉴定方法
▪ PCR ▪ Southern blot ▪ 染色体原位杂交 ▪ Northern blot ▪ RT-PCR ▪ Western blot
获得病毒颗粒感染早期胚胎 包装细胞与早期胚胎共培养
感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育
成携带外源基因的动物。
逆转录病毒感染法
外源基因 逆转录病毒载体
四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 逆转录病毒感染 纯合体小鼠 嵌合小鼠
逆转录病毒感染法的特点
通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将 外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率 高。
胚胎干细胞外源 DNA 的导入
DNA
磷酸钙-DNA 共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法
胚胎干细胞
囊胚
微注射
原囊胚
转基因动物
外源 DNA 的整合
▪ 用于 ES 细胞的 DNA 载体一般带有定点整
合元件, 避免了随机整合。
▪ 定点整合位点应选择在基因组内编码非必
需产物的地方，以减少整合对细胞正常功 能的影响。
DNA 显微注射
DNA注射针
持卵管
精原核 卵原核
DNA 显微注射
DNA 显微注射到尚未发生核融合的受精卵 的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原 核大，容易辨别。
线性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出数 倍，因而用于显微注射的转入基因通常是 去除载体序列的线状 DNA。
DNA 显微注射法的特点
反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段 DNA(＜10kb)。
对家禽类的转基因研究有重要意义。
4）精子载体法
外源 DNA 共育法 脂质体转染法 电穿孔法
精子 卵细胞
受精卵
转基因动物
DNA
精子 卵细胞
DNA 磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法
胚胎干细胞
受精卵
四细胞 胚胎
微注射 囊胚 原肠胚
▪ DNA 大小无限制，最大可达 250Kb。 ▪ 随机整合：在染色体上整合的位点是随
机的，整合的拷贝数也不一定。
▪ 转入的基因有可能碰巧整合到具有重
要功能的基因之中，干扰该基因的正 常表达，影响转基因动物的正常发育 和代谢。
▪ 总效率较低(实际成功率1/1000)。
提高显微注射 DNA 表达的成功率