乳糖酶的筛选与纯化
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乳糖酶制剂的生产
马洪海 M100250427
乳糖酶分布
• 乳糖酶(lactase)称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(βD-galactohydrolase)，简称β-半乳糖苷酶(βgalactosidase),根据不同来源可分为胞内酶或胞外 酶。 • 乳糖酶广泛地存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡 豆等植物中；大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉 菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官 和皮肤组织中。现在商业上所有的β-半乳糖苷酶 都来源于微生物发酵法，基本上由酵母和霉菌发 酵获得。
乳糖酶的提取方法
乳糖酶的浓缩与提纯步骤为： 乳糖酶的浓缩与提纯硫酸铵分级盐析、脱盐、离子 交换层析、分子筛层析、 交换层析、分子筛层析、第二次离子交换 层析、 层析、PAGE电泳鉴定 电泳鉴定
产乳糖酶菌种的保藏
1、准备安焙管 、 2、准备菌种 、 3、制备菌悬液及分离 、 4、冷冻：迅速降温至 ～-70℃ 、冷冻：迅速降温至-40～ ℃ 5、抽真空：完成时有干燥块 、抽真空： 6、抽真空，封口 、抽真空， 7、冰箱保藏 、
微生物产酶性能的进一步提高
• 紫外线诱变或亚硝酸诱变获得高产菌种的 突变体。 突变体。 • 利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生 物的酶产量。调整优化培养基成分， 物的酶产量。调整优化培养基成分，消除 产物抑制等负面因素。 产物抑制等负面因素。 • 运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌 运用遗传工程、 株中的目的基因转移到另外一些对生产环 境更适应性的微生物细胞之内， 境更适应性的微生物细胞之内，使其高效 表达。 表达。
菌液的制备
取适量斜面菌种接种于种子培养基中, 取适量斜面菌种接种于种子培养基中 摇 床培养: 培养24 。 床培养 30 ℃, 180 r/min, 培养 h。 将培养好的种子培养液按10%量接种于液 量接种于液 将培养好的种子培养液按 态发酵培养基中。发酵条件:摇床培养 态发酵培养基中。发酵条件 摇床培养 28℃,180r/min,培养 培养36h,初始 初始pH7-7.5。 ℃ 培养 初始 。
2011-1-6
样品采 集与富集培养
在乳制品厂附近富含乳糖的土壤中取离 地面5到 处土样几克,盛于预先灭菌的牛皮 地面 到15cm处土样几克 盛于预先灭菌的牛皮 处土样几克 纸袋中扎紧，采样深度0～ 厘米。 纸袋中扎紧，采样深度 ～20 厘米。 用乳糖作为唯一碳源的液体培养基增殖。 用乳糖作为唯一碳源的液体培养基增殖。
THANK YOU ！
初筛与复筛
平板划线分离或涂布，利用透明圈法， 初筛 ：平板划线分离或涂布，利用透明圈法， 依据透明圈大小挑选菌种。 依据透明圈大小挑选菌种。 也可采用变色圈法 指示剂用溴甲酚绿。 变色圈法， 也可采用变色圈法，指示剂用溴甲酚绿。 在分离培养基PH6.8中加入溴甲酚绿指示剂 在分离培养基 中加入溴甲酚绿指示剂 后呈蓝绿色， 后呈蓝绿色，当细菌在该培养基中生长并 分解乳糖产生乳酸之后使菌落呈黄色， 分解乳糖产生乳酸之后使菌落呈黄色，菌 落周围的培养基也变为黄色。 落周围的培养基也变为黄色。
注意事项
1、保持待测材料的酶活 、 2、在分光光度计下待测时控制 、 反应时间
以分光光度计法为例：
以邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG) 为反应底物，在一定反应条件下水 解 10 min，生成邻硝基酚(ONP)和半 乳糖，邻硝基酚在中、碱性范围呈 黄色,在420nm有最大吸收峰。用分 光光度计测定所生成的邻硝基酚的 量，与标准曲线比较后定量。
复筛包括夹层法和点种 复筛 :复筛包括夹层法和点种 法。复筛步骤以质为主，应精 复筛步骤以质为主， 确测定每个菌株的生产指标， 确测定每个菌株的生产指标， 从而筛选出产酶量高、 从而筛选出产酶量高、性能更 符合生产要求的菌种。 符合生产要求的菌种。
测定酶活
测定原理
邻硝基酚-β-D-半乳糖苷 半乳糖苷(ONPG) 邻硝基酚 半乳糖苷 为易溶于水的无色化合物,β-D为易溶于水的无色化合物 半乳糖苷酶催化ONPG水解生成 半乳糖苷酶催化 水解生成 邻硝基苯酚(ONP),ONP在中、 在中、 邻硝基苯酚 在中 碱性范围呈黄色,在 碱性范围呈黄色 在420nm有最 有最 大吸收峰。 大吸收峰。
马洪海 M100250427
乳糖酶分布
• 乳糖酶(lactase)称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(βD-galactohydrolase)，简称β-半乳糖苷酶(βgalactosidase),根据不同来源可分为胞内酶或胞外 酶。 • 乳糖酶广泛地存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡 豆等植物中；大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉 菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官 和皮肤组织中。现在商业上所有的β-半乳糖苷酶 都来源于微生物发酵法，基本上由酵母和霉菌发 酵获得。
乳糖酶的提取方法
乳糖酶的浓缩与提纯步骤为： 乳糖酶的浓缩与提纯硫酸铵分级盐析、脱盐、离子 交换层析、分子筛层析、 交换层析、分子筛层析、第二次离子交换 层析、 层析、PAGE电泳鉴定 电泳鉴定
产乳糖酶菌种的保藏
1、准备安焙管 、 2、准备菌种 、 3、制备菌悬液及分离 、 4、冷冻：迅速降温至 ～-70℃ 、冷冻：迅速降温至-40～ ℃ 5、抽真空：完成时有干燥块 、抽真空： 6、抽真空，封口 、抽真空， 7、冰箱保藏 、
微生物产酶性能的进一步提高
• 紫外线诱变或亚硝酸诱变获得高产菌种的 突变体。 突变体。 • 利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生 物的酶产量。调整优化培养基成分， 物的酶产量。调整优化培养基成分，消除 产物抑制等负面因素。 产物抑制等负面因素。 • 运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌 运用遗传工程、 株中的目的基因转移到另外一些对生产环 境更适应性的微生物细胞之内， 境更适应性的微生物细胞之内，使其高效 表达。 表达。
菌液的制备
取适量斜面菌种接种于种子培养基中, 取适量斜面菌种接种于种子培养基中 摇 床培养: 培养24 。 床培养 30 ℃, 180 r/min, 培养 h。 将培养好的种子培养液按10%量接种于液 量接种于液 将培养好的种子培养液按 态发酵培养基中。发酵条件:摇床培养 态发酵培养基中。发酵条件 摇床培养 28℃,180r/min,培养 培养36h,初始 初始pH7-7.5。 ℃ 培养 初始 。
2011-1-6
样品采 集与富集培养
在乳制品厂附近富含乳糖的土壤中取离 地面5到 处土样几克,盛于预先灭菌的牛皮 地面 到15cm处土样几克 盛于预先灭菌的牛皮 处土样几克 纸袋中扎紧，采样深度0～ 厘米。 纸袋中扎紧，采样深度 ～20 厘米。 用乳糖作为唯一碳源的液体培养基增殖。 用乳糖作为唯一碳源的液体培养基增殖。
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初筛与复筛
平板划线分离或涂布，利用透明圈法， 初筛 ：平板划线分离或涂布，利用透明圈法， 依据透明圈大小挑选菌种。 依据透明圈大小挑选菌种。 也可采用变色圈法 指示剂用溴甲酚绿。 变色圈法， 也可采用变色圈法，指示剂用溴甲酚绿。 在分离培养基PH6.8中加入溴甲酚绿指示剂 在分离培养基 中加入溴甲酚绿指示剂 后呈蓝绿色， 后呈蓝绿色，当细菌在该培养基中生长并 分解乳糖产生乳酸之后使菌落呈黄色， 分解乳糖产生乳酸之后使菌落呈黄色，菌 落周围的培养基也变为黄色。 落周围的培养基也变为黄色。
注意事项
1、保持待测材料的酶活 、 2、在分光光度计下待测时控制 、 反应时间
以分光光度计法为例：
以邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG) 为反应底物，在一定反应条件下水 解 10 min，生成邻硝基酚(ONP)和半 乳糖，邻硝基酚在中、碱性范围呈 黄色,在420nm有最大吸收峰。用分 光光度计测定所生成的邻硝基酚的 量，与标准曲线比较后定量。
复筛包括夹层法和点种 复筛 :复筛包括夹层法和点种 法。复筛步骤以质为主，应精 复筛步骤以质为主， 确测定每个菌株的生产指标， 确测定每个菌株的生产指标， 从而筛选出产酶量高、 从而筛选出产酶量高、性能更 符合生产要求的菌种。 符合生产要求的菌种。
测定酶活
测定原理
邻硝基酚-β-D-半乳糖苷 半乳糖苷(ONPG) 邻硝基酚 半乳糖苷 为易溶于水的无色化合物,β-D为易溶于水的无色化合物 半乳糖苷酶催化ONPG水解生成 半乳糖苷酶催化 水解生成 邻硝基苯酚(ONP),ONP在中、 在中、 邻硝基苯酚 在中 碱性范围呈黄色,在 碱性范围呈黄色 在420nm有最 有最 大吸收峰。 大吸收峰。