第三代测序技术单分子即时测序

第三代测序技术:单分子即时测序

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第三代测序技术：单分子即时测序

刘岩吴秉铨

ＤＮＡ测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的

发展。从人类基因组计划

（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ），到人类基因组单倍型图计划

（ＨａｐＭａｐ），再到人类癌症基因组及个体基因组计划，第一代和第二代ＤＮＡ

测序技术功不可没。特别是近几年发展起来的第二代ＤＮＡ测序技术则使得ＤＮＡ测序进

入了高通量、低成本的时代。目前，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该

技术测定ＤＮＡ序列更快，并有望进一步降低测序成本，为人类从基因水平深入理解疾病

的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段，使个体化医疗成为现实。本文回顾了测序技术

发展过程，并对第三代测序技术的特点和优势进行详细论述。

一、第一代ＤＮＡ测序（ｆｉｒｓｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

ＤＮＡ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）

成熟的ＤＮＡ测序技术始于２０世纪７０年代中期，１９７７年Ｍａｘａｍ和Ｇｉｌ

ｂｅｒｔ…报道了通过化学降解测定ＤＮＡ序列的方法。同一时期，Ｓａｎｇｅｒ等拉１

发明了双脱氧链终止法，基本原理是利用４种双脱氧核苷酸（ｄｄＮＴＰ）代替脱氧核苷

酸（ｄＮＴＰ）作为底物进行ＤＮＡ合成反应。一旦ｄｄＮＴＰ掺入到ＤＮＡ链中，由于

核糖的第３位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，ＤＮＡ合成链

的延伸反应被终止，生成了若干长度仅相差单个碱基的ＤＮＡ片段。在４个ＤＮＡ合成反

应体系中，分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ｄｄＮＴＰ，通过单碱基分

辨率的凝胶电泳分离不同长度的ＤＮＡ片段和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定

待测ＤＮＡ分子的序列。

２０世纪９０年代初出现的荧光自动测序技术也是基于Ｓａｎｇｅｒ等¨１原理。但

用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了ＤＮＡ测序的速度

和准确性，将ＤＮＡ测序带入自动化测序的时代，这些技术统称为第一代ＤＮＡ测序技术。随后，平板电泳分离技术被毛细管电泳所取代，并且通过更高程度的并行化使得同时进行

测序的样本数量成倍增加。目前应用最广泛的ＡＢＩ３７３０系列自动测序仪，即是基于

毛细管电泳和荧光标记技术的ＤＮＡ测序仪，在一次运行中可分析９６个样本。

第一代测序技术。在人类基因组计划ＤＮＡ测序的后期阶段起了关键作用，加速了人

类基因组计划的完成。通过几十年的逐步改进，第一代测序仪的读长可以超过１０００ｂｐ，原

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－５８０７．２０１１．１０．０２２作者单位：１００１９１北京大学医学部病理学系通信作者：吴秉铨。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｑｗｍｄ＠ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃａ

万方数据

．综述．

始数据的准确率可以高达９９．９９９％，测定每千碱基长度序列的成本是０．５美元，每天的数据通量可以达到６０００００

ｂｐ。

尽管由于对电泳分离技术的依赖，第一代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限，但因其久经考验的准确性和初具规模的市场占有率，第一代测序技术并不会很快退出历史

舞台，它将与新的若干代测序平台并存，特别是在ＰＣＲ产物测序、质粒和细菌人工染色

体的末端测序以及短串联重复

（ｓｈｏｒｔｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ，ＳＴＲ）基因分型方面继续发挥重要作用。

二、第二代ＤＮＡ测序（ｓｅｃｏｎｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

ＤＮＡ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）

随着人类基因组计划的完成，后基因组时代，即功能基因组时代已向我们走来。第一

代测序方法已经不能满足深

度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了第二代测序，又称下一代测

序（ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）的诞生。

第二代测序方法，将基因组ＤＮＡ用限制性内切酶切割成一定长度范围的ＤＮＡ片段（即ＤＮＡ文库），然后在其两侧连上接头，用ＰＣＲ方法扩增出几百万个拷贝（克隆）

并固定于平板基质上，每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成且可以被同时并行分析。

测序过程根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序＂１和连接酶合成测序ＭＪ。前者使

用修饰的ＤＮＡ聚合酶和标记了光学信号的某种ｄＮＴＰ混合试剂进行单碱基延伸测序反应，后者则是利用ＤＮＡ连接酶和荧光标记的寡核苷酸探针的混合试剂。每一次反应都包

括混合试

剂掺入一合成链延伸一个碱基一光学信号采集一未反应试剂的洗涤４个步骤，经过这

种重复的掺人一延伸一采集一洗

涤的过程，ｄＮＴＰ标记的光学信号能够通过显微设备观察成像并被不断记录下来，

最后经过计算机分析就可以获得完整的ＤＮＡ序列信息，是一种边合成、边测序的技术。

第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条ＤＮＡ片段进行

序列测定，使得对一个物种的转录组（ＲＮＡ）测序或基因组（ＤＮＡ）深度测序变得方

便易行”Ｊ。该技术已逐步应用于多项人类基因研究，如单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ

ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）研究、小分子

ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）以及转录调控研究等。

第二代测序平台主要包括Ｒｏｃｈｅ４５４ＧＳ

ＦＬＸ测序平

台、Ｓｏｌｅｘａ

Ｇｅｎｏｍｅ

Ａｎａｌｙｚｅｒ测序平台和ＡＢＩＳＯＬＩＤ测序平

台【６４Ｊ，并于２００５年前后实现商业化，使用第一代Ｓａｎｇｅｒ等

的测序技术完成的人类基因组计划，花费了３０亿美元巨资，用了３年的时间；然而，使用第二代测序技术，完成一个人的基因组测序只需要１周左右的时间，费用降低到１０

万美元

以下。

上述３种第二代测序技术平台各有所长，但亦各有所限。Ｒｏｃｈｅ４５４以焦磷酸

测序为基础，主要优势是它的速度和读长（将近５００个碱基），但易出现同聚核苷酸导

致的插入．缺失错误，如５＇－ＧＧＧＧ－３’被误读为５＇－ＧＧＧＧＧ－３’或５’

－ＧＧＧ－３’。与Ｒｏｃｈｅ４５４相比，Ｓｏｌｅｘａ和ＳＯＬＩＤ拥有更高的通量

和更低的成本，具有识别错误碱基的优点，但序列读长相对较短仍是主要的技术瓶颈，应

运而生的第三代单分子测序技术是解决这一问题的一种方案。

三、第三代ＤＮＡ测序（ｔｈｉｒｄ・ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）

第三代测序技术，也被称为“下、下一代测序（ｎｅｘｔ－ｎｅｘｔ—