从土壤中分离纯化微生物

二、实验原理－－甲基红试验
甲基红(Methyl red)试验(该试验简称MR试验)

很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸 再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低 到4.2以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指 示剂变色范围是pH4.4(红色)～pH6.2(黄色)。若某些细菌如 产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱羧， 转化成醇等物，则培养基的pH仍在6.2以上，故此时加入甲 基红指示剂，呈现黄色。
二、实验原理－－大分子物质的水解试验
微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，
必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利 用。
微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）将大分子物质的分
解过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
例如：淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用
铜绿假单胞菌、变形杆菌和产气杆菌菌种的斜面各1支。
试剂：卢戈氏碘液、中性红试剂、甲基红试剂、溴甲酚紫
等；培养基各成份。
其他实验器材：培养皿、接种环、试管、试管架、酒精灯、
记号笔、德汉氏小管、 37℃恒温培养箱等。
四、实验步骤
淀粉水解试验

将配制好的淀粉培养基冷却到50℃左右，以无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底部划分成4部分。 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌 分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别做好标记。 将平板倒置在37℃温箱培养24h。 将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻 摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明 圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀 粉能力的大小。
二、实验原理
细菌生化试验：在生活细胞中存在的化学反应称之
为代谢。代谢过程主要是酶促反应过程。各种微生物
在代谢类型上表现出很大的差异，反应出它们具有不 同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作细菌 鉴定和分类的内容。用生化试验的方法检测细菌对各 种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种 属，称之为细菌的生化反应。
二、实验原理－－吲哚试验
吲哚实验
有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲
哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，就会形成 红色的玫瑰吲哚。
色氨酸水解反应
吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应
大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
三、实验器材
试验菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、

将已接种好的培养基置37℃温箱中培养24h。 观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pH降低， 这时培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色)，若发酵培养基中的糖产酸产 气，则培养基不仅显酸色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管(德汉氏 小管)中有气体。若被检细菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。
四、实验步骤
糖(醇)类发酵试验

编号： 在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下 同。

接种： 取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种 普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1 支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。
四、实验步骤
甲基红试验(MR试验)

将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中， 37℃培养 48h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者 为阳性，呈现黄色者为阴性。
吲哚实验

将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接种于2支蛋白胨水培养基中 （做吲哚试验），置37℃温室中培养2天，向蛋白胨水培养物 内加3—4滴乙醚，摇动数次，静置1~3分钟，待乙醚上升后， 沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色 环状物为阳性反应。
实验十
细菌的生理生化反应
庞昕 山东大学微生物技术国家重点实验室
一、实验目的和要求
1.
了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常 用的生理生化反应的测定方法； 通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利 用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性；
2.
3.
了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及其代
谢产物在鉴别细菌中的意义。
碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
二、实验原理－－大分子物质的水解试验
淀粉水解试验

细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶(淀 粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或 麦芽糖)，再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过 底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。

四、实验步骤
油脂水解试验

将配制好的固体油脂培养基冷却到50℃左右，充分摇匀，使油 脂均匀分布，以无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底部划分成4部分。 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌

分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别做好标记。

将平板倒置在37℃温箱培养24h。 将平皿取出，观察菌苔颜色。如出现红色斑点，说明脂肪水解， 为阳性反应。
油脂水解试验

脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低， 加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深 红色，说明细胞外存在脂肪酶。
二、实验原理－－糖发酵试验
糖(醇)类发酵试验

不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因而发酵糖(醇)的能
力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产 气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在 配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)~6.8(紫色)]， 当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可 由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。
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淀粉水解实验
糖发酵实验
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吲哚实验
甲基红实验
五、实验报告
1.将结果填入下表。“＋”表示阳性，“－”
表示阴性。
菌名 枯草芽孢 杆菌 大肠杆菌 金黄色葡 萄球菌 铜绿假单 胞菌
淀粉水解 试验
油脂水解 试验
五.实验报告
2.将结果填入下表。“+”表示产酸或产气，“-”