过氧自由基清除能力测定法-操作图解

过氧自由基(•O2-)的清除能力（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂）

操作图解

具体方法

1 溶液配制

1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。

1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。

1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）

40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH

计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。

1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）

取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。

2 测试液

2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）

ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。

3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液）

ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。

3 计算公式

清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0 *100

4 注意事项

由于连苯三酚自氧化反应对温度和pH值很敏感，而pH值又受温度的波动而变化。因此，实验过程中，要严格控制温度。缓冲液宜多，比色皿用3.5mL规格。这样数据才比较稳定。

5 实验结果（以原儿茶酸为例）

采用文献[1]的改进方法，测原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力，结果如图2（pH7.4）。用旧方法，在pH8.2时测量，结果有很大误差，是不可取的。

图2 原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力的对比（pH7.4 vs pH8.2）

参考文献:

[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.

致谢：本文由广州中医药大学李熙灿教授依据其发表的论文[1]，整理而成。