生化 纳米抗体

纳米抗体
NANOBODY
抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分 子量较大的相同的重链（H链）；2条较短、相对分子量较 小的相同的轻链（L链）。链间由二硫键和非共价键联结 形成一个由4条多肽链构成的单体分子。整个抗体分子可 分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体 分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可 变区位于"Y"的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸 残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更 易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面，高变区 氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性。一个抗 体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称 抗原结合片段（antigen-binding fragment, Fab）。"Y" 的柄部称结晶片段（crystalline fragment,FC），糖结合 在FC 上。可变区:免疫球蛋白轻链和重链靠近N端氨基酸 序列变化较大的区域称为可变区。可变区，分别占重链和 轻链的1/4和1/2。
纳米抗体的结构特性
⑴热稳定性 ⑵识别的特异性 。纳米抗体除了可以识别一些常规的表位外，由于其分子量很小， CDR3区较长，还可以识别常规抗体无法识别的抗原表位，例如酶的活性位点和一些 保守的凹陷的表位。然而，一些半抗原和小分子多肽，通常结合在VH-VL的缝隙中， 很难和VHH结合。 ⑶组织渗透性。 纳米抗体的分子量很小，很容易从肾小球滤过，导致VHH很快从血 浆中清除，使VHH的半衰期很短。Cortez-Retamozo等利用纳米抗体偶联毒素物质作 用于肿瘤细胞，其穿透性好，特异的作用于肿瘤细胞，不会引起其它组织损伤。 ⑷表达性。 适合于原核表达和各种真核表达系统，氨基酸的差异对表达量有很大的 影响。
百度文库
纳 米 抗 体 产 生 历 史
1993年比利时科学家首次在NATURE报道[1]：在骆驼 血液中的抗体，有一半没有轻链，而且更让人惊喜的 是，这些缺失轻链的“重链抗体” (HEAVY-CHAIN ANTIBODIES, HCABS)能像正常抗体一样与抗原等靶标 紧密结合，另外不像SCFV那样互相沾粘，甚至聚集成 块。这种抗体只包含一个重链可变区(VARIABLE DOMAIN OF HEAVY CHAIN OF HCAB, VHH)和两个常 规的CH2与CH3区，更重要的是单独克隆并表达出来 的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性， VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位，所以 VHH也称NANOBODY（纳米抗体）
纳米抗体的应用
• 用于生物医药研发(基因工程药物研发、ADC药物研发);
• 用于临床体外诊断(胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发 光法); • 用于肿瘤研究、免疫学研究等基础研究;
用作肿瘤的诊断和治疗 抗肿瘤研究存在两大难题：①早期诊断、②靶向治疗。此二者不仅要求药物在体内迅速到达 疾病部位，而且要求对正常组织损伤降到最低。目前已有多种抗体药物可供治疗肿瘤。但是 因为这些抗体属于大型蛋白质，难以穿透肿瘤细胞；并且他们的复杂结构使得大量生产非常 困难且昂贵，因此在治疗癌症方面仍有改善空间。 纳米抗体远小于常规抗体，且保有对肿瘤具专一性的特性；其稳定，分子量小，属水溶性蛋 白质，使生产更容易且便宜。因此，在肿瘤的诊断与治疗方面比其他抗体更具优势。研究表 明一种与表皮生长因子竞争的纳米抗体，与表皮生长因子受体结合，以阻碍表皮生长因子与 其特异性受体结合，从而阻断其信号通路，抑制肿瘤新生血管的形成。
抗体(Ab)的重链和轻链可变区内的高变区构成抗体 分子的抗原(Ag)结合点,因为抗原结合点是与抗原表 位结构相互补的,所以高变区又称为抗体分子的互补 决定区(complementarity-determining region,CDR) VH和VL的三个HVR共同组成Ig 的抗原结合部位，该部位也称为CDR
用于神经性疾病的治疗 药物透过血脑屏障准确到达疾病发生部位，是神经性疾病治疗面临的一大挑战。利用纳米抗 体可有效的解决这一问题，将神经性药物连接到特异的纳米抗体，该抗体能将药物运输到大 脑的特定部位，使药物发挥疗效。纳米抗体分子量小，稳定性高，组织渗透性强，耐高温、 pH、盐等特性，使其在这方面的应用有很大的优越性。 纳米抗体作为一种新型抗体，具有完整的抗原结合能力。其分子量小、特异性强、组织渗 透性高以及易于表达等优越性，使其在抗炎、抗感染及风湿性疾病等方面也具有很大的发展 前景。
A图：传统四链结 构的抗体；B图： 骆驼血液中的重链 抗体；C图：稳定 的可结合抗原的最 小单位VHH也称 Nanobody
纳米抗体产生历史
纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中 首次报道，羊驼血液中的抗体有一半天然缺失轻链和 重链恒定区 1( C H1) ，克隆这种抗体重链的可变区， 构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体( V HH) ， 现已被重新命名为"纳米抗体"( nanobody) ，它是具 有完整功能的最小的抗原结合片段。
噬菌体展示羊驼纳米抗体文库制备
噬菌体展示技术（Phage Display）一种基因表达产物和亲和选择相 结合的技术，是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白 结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时， 外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
噬菌体展示羊驼纳米抗体制备步骤 ： 1、采取免疫或未免疫的羊驼外周血 液； 2、提取总的mRNA，反转录成 cDNA； 3、利用巢式PCR扩增VHH，使用限 制性内切酶酶切噬菌体展示载体及 VHH并连接两个片段； 4、将连接产物电转化至感受态TGl 中，构建天然或免疫的羊驼源噬菌 体展示纳米抗体文库。 5、多次筛选得到抗原特异的nb
易获得 (免疫，B淋巴细胞分离，抗体库展示技术筛选)
抗体的纳米优势
2，稳定性好 (内部折叠中含有多个二硫键，使其结构具有很好的稳 定性，可在常温放置)[4]
3，可溶性高 (不象scFv那样容易聚集成团，VHH亲水性好，具有很 好的水溶性，提高作为药物的利用率) 4，吸收好 (因为可溶性高，所以Nanobody具有高吸收率的优点) 5，表达容易 (不象传统抗体那样必须要在哺乳动物细胞中进行表达 ，难度大，产量低，成本高，VHH可以在原核细胞中进行高效表达 ，有研究者可将产量提高到2.5g/L) 6，人源化简单 (与人类重链基因同源性在80%-90%，人源化已经取得 成功)[5] 7，偶联其他分子容易