PCR法定性检测食用油脂中转基因成分_覃文

收稿日期:2002—01—15
作者简介:覃　文(1957—),女,高级工程师/博士后;研究方向为食品及动物产品生物检测。

文章编号:1003—7969(2002)02—0004—03 中图分类号:TQ646.4 文献标识码:A
PCR 法定性检测食用油脂中转基因成分
覃　文,董　洁,邓鸿铃,高东微
(广州出入境检验检疫局食品实验室,510623广州市珠江新城花城大道66号)
摘要:食用油脂(尤其是精炼油)被认为几乎不含DNA 和蛋白质等生物大分子。

针对食用油脂中DNA 含量极低、破坏严重的特点,成功地建立了食用油脂中DNA 提取方法,并从中检测出玉米、大豆内源基因(IVR 、Lectin )以及外源抗虫基因[Cr yIA (b )]和抗除草剂基因(EPSPS ),为油脂进行核酸类生物性检测提供了一种简捷有效的方法。

关键词:食用油脂;DNA ;提取;转基因检测
对食用油脂的检验,一直是以食用油卫生标准
中的酸值、过氧化值、羰基值、黄曲霉毒素[1,2]等与安全卫生有关的检验项目进行检验。

随着生物技术的发展、人民生活水平的提高,对食用油脂的检验,将会逐渐扩展到对核酸、蛋白质等生物大分子的检验。

近年来,我国进口的制油原料中,有相当数量是转基因产品。

由于目前世界上已有不少国家规定了转基因食品必须加贴标签或禁止进口,因此,对食用油脂进行转基因成分的检测,就显得尤为重要。

如何鉴别食用油脂是否为转基因食品,除了检测原料以外,更多的情况下,是需要从成品食用油中直接进行检测,而从食用油脂中提取出可用于核酸检验的DNA ,是进行该项检验的关键步骤。

目前尚未见有关从食用油脂中提取DNA 的报道。

本文介绍一种稳定有效且简便易操作的从大豆油、玉米胚芽油等食用油脂中提取DNA 的方法。

用该方法提取的DNA ,可以用于转基因成分以及其他核酸成分的检测。

本文针对已商品化的转基因大豆、玉米中的外源基因,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Re -action ,PCR )及基因片段扫描(GeneScan )技术进行检测。

1　材料与方法1.1　材料
食用油脂购自超级市场,部分样品为送检样品。

1.2　仪器、试剂
水浴锅,旋涡振荡器,核酸蛋白分析仪,定性(定量)PCR 仪,DNA 测序仪等;PCR 试剂(Promega )及
GeneScan 试剂(Applied Biosystems )。

1.3　方法
食用油脂中DNA 的提取:在2ml 离心管中加入1ml 食用油及400μl TE (Tris -EDTA ),颠倒混匀5min 后13000r /min 室温离心5min 去上层油脂层;将离心管中余下的约400μl 水相溶液按照Wizard ®Genomic DNA Purification Kit (Promega )说明书操作步骤提取DNA ;在沉淀DNA 之前,向离心管中加入≥1μg 植物基因组DNA 作为担体,并加入600μl 室温异丙醇,颠倒混匀2-5次后室温静置45min -60min 沉淀DNA ;沉淀的DNA 经离心、70%乙醇洗涤并干燥后,加入TE 溶液溶解DNA ,置于4℃保存备用。

PCR 扩增玉米内源基因IVR 、大豆内源基因Lectin 以及外源基因Cr yIA (b )、EPSPS 所用引物[3]由宝生物合成,PCR 反应体系和反应条件见文献[4]。

从DNA 提取开始,所有实验均设有空白对照、阴性对照及阳性对照。

同时,本研究还应用荧光实时定量PCR 技术(相当于定性PCR 与分子杂交),对PCR 结果进行验证(结果未显示)。

2　结果与讨论2.1　结果
2.1.1　食用油脂中玉米内源基因I VR 和大豆内源基因Lectin 的检测　检测玉米、大豆的植物内源基因,可以判断从食用油脂中是否成功地提取到DNA ,以及所提取的DNA 是否适合用于PCR 扩增,同时还可以判断所提取的DNA 提取液中是否含有PCR 扩增抑制物,从而避免出现最终检测结果的假阴性。

图1、图2分别显示采用PCR -GeneScan 法检测食用油脂中玉米内源基因IVR 和大豆内源基因Lectin 的结果。

4
中　国　油　脂 2002年第27卷第2期
Dye /Sampl e Peak Minutes
Size
Peak Height Peak Area Data Point
2B ,
8619.23221.89
2068
2886752432B ,8719.30224.0824626385052624B ,9118.88221.9213461487751484B ,9218.95224.1515563802051676B ,8618.71221.7515401602951036B ,8818.79224.1313132437551237B ,9519.09221.8412281410052057B ,9619.13223.006157082521511B ,6218.77221.84264535339511711B ,6418.84224.203290396755137
图1　食用油中玉米内源基因IVR 的检测自上而下:1、2玉米胚芽油;3、4混合油脂; 5空白对照;6阴性对照;7阳性对照。

Dye /Sampl e Peak Minutes Size Peak Height Peak Area Data Point
14G ,2315.66184.55
133
1144427114G ,2415.71186.071001352428416G ,1915.65184.461621512426716G ,2015.69185.741391684427821G ,2815.64184.33425137229426421G ,2915.68185.745262602614276
图2　食用油中大豆内源特异基因Lectin 的检测
自上而下:1、2大豆色拉油;3空白对照; 4阴性对照;5阳性对照。

由于食用油脂中DNA 含量非常低,提取后目标
DNA 含量及纯度的测定,若采用常规的凝胶电泳或紫外分光光度法,无法确定所提取的DNA 是否含有目标DNA ,凝胶电泳上所显示的条带以及从紫外获取的OD 值,都可能是担体DNA 和目标DNA 的混合信息。

因此,食用油脂中所含的DNA 提取是否成功,只有使用特异引物,将目标DNA 通过PCR 扩增来判断,如本研究中制油原料内源基因的检测。

从图1、2中可以看出,在市售的玉米胚芽油、大豆色拉油以及送检的混合油脂样品中,分别检出玉米和大豆的内源基因,说明DNA 的提取是成功的。

2.1.2　食用油中抗虫基因和抗除草剂基因的检测
除了检测内源性特异基因外,本研究还检测了外源基因抗虫Cr yIA (b )基因及抗除草剂EPSPS 基因。

由于本研究中使用的检测外源基因的引物,与检测制油原料(转基因大豆、玉米)的引物相同,因此,在成品食用油脂中检出外源基因,说明该食用油脂的制油原料含有转基因大豆或玉米。

见图3、4。

D ye /Sample Peak Minutes Siz e Peak Height Peak Area Data Point
7B ,
6117.50181.62
658
674647717B ,6217.54182.75647749847827B ,6317.64185.526911195548098B ,6217.55181.68660665247848B ,6317.59182.81482555947958B ,6417.68185.4760410401482110B ,6017.58181.744654687479410B ,6117.62182.863463964480510B ,6217.72185.504377426483113B ,5317.59181.64130513900479513B ,5417.63182.77145619089480613B ,5517.72185.521402262874833
图3　食用油中抗虫基因CryIA (b )的检测
自上而下:1、2玉米胚芽油;3、4混合油脂; 5空白对照;6阴性对照;7阳性对照。

5
2002年第27卷第2期 中　国　油　脂
Dye /Sampl e Peak Minutes
Size
Peak Height Peak Area Data Point
7B ,
4315.10126.85
603
501941177B ,4415.13127.79295309141267B ,4515.21129.88712594841467B ,4615.24130.72481495641548B ,3814.90126.86515385040628B ,3914.93127.82214242540718B ,4015.00129.83624489540908B ,4115.03130.693653083409813B ,3414.55126.24186314765396613B ,3514.58127.363353589397613B ,3614.65129.38223416696399413B ,3714.67130.1756343914001
图4　食用油中抗除草剂基因EPSPS 的检测
自上而下:1、2辣椒油;3空白对照; 4阴性对照;5阳性对照。

2.2　讨论
对食用油脂进行转基因成分的检测,是油脂检
验工作中急需解决的问题,其首要前提是需要从油
脂中提取出适合于PCR 扩增的DNA 。

由于食用油脂经过精炼等加工步骤之后,所残留的核酸被严重破坏成碎片状,且含量极低。

因此,提取开始前,利用DNA 可溶于水溶液的特性,在食用油脂中加入一定体积的TE 溶液进行洗涤,这一步骤对于成功提取DNA 至关重要。

洗涤时的操作手法对于DNA 的得率有一定的影响。

担体DNA 的选择,最好选择与目标DNA 的物种相差较远的植物、动物或微生物DNA 。

本研究所选用的担体,不影响待测目标DNA 的检出,并作为PCR 反应时的阴性对照。

油脂中的DNA 提取是否成功,可以通过检测该油脂所用原料的植物内源特异基因,如玉米油中的I VR 、大豆油中的Lectin 等进行验证。

目前,食用油脂的制油原料已部分使用转基因产品(转基因玉米、转基因大豆、转基因油菜籽)。

因此,除了检测制油原料的自身基因外,本研究通过检测外源基因来验证所提取的DNA 是否适用于其他外源基因的检测。

结果显示,在食用油脂中亦可检出抗虫基因Cr yIA (b )和抗除草剂草甘膦EPSPS 基因。

由此可见,本研究所建立的食用油脂DNA 提取方法简单方便,也可用于不同基因的检测。

参　考　文　献
[1]　GB 2716-1988,食用植物油卫生标准[S ].[2]　GB 15197-1994,精炼食用植物油卫生标准[S ].[3]　Carolyn D .Hurst ,Angus Knight ,Ian J Bruce .PCR detec -tion of geneticall y modified soya and maize in foodstuffs [J ].Molecular Breeding ,1999,5:579-586.
[4]　覃　文,董　洁,等.食品中转基因成分的检测[J ].食
品科学,2001,22(7):59-62.
Qualitative Detection for Geneticall y Modified Organisms in Edible Oils by PCR
QIN Wen ,DONG Jie ,DNEG Hong -ling ,GAO Dong -wei
(Guangzhou Entry -Exit Inspection &Quarantine B ureau of the P .R .of China ,510623Guangzhou )
A bstract :A qualitative method for detecting of transgenic genes in edible oils was reported .It is nor mally consid -er ed that the edible oils ,especially refining oils ,did not contain any DNA ,RNA and proteins .This study has estab -lished a useful method for extraction DNA from the edible oil samples and extracted DNA can be used as template for PCR .The endogenous genes (IVR ,Lectin )and transgenic genes (Cry ,EPSPS )were detected in the edible oil sa mples by the PCR -GeneScan method .
Key words :edible oil ;extraction ;DNA ;detection GMOs
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中　国　油　脂 2002年第27卷第2期。