植物多酚氧化酶活性测定方法的改进

第25卷第1期2005年1月

云南师范大学学报

Journal of Y unnan N ormal University

V ol.25N o.1

Jan.2005植物多酚氧化酶活性测定方法的改进Ξ

李忠光,　龚　明

(云南师范大学生命科学学院,云南昆明650092)

摘　要:　文章介绍了多酚氧化酶反应产物邻醌的吸收光谱和酶测定反应的动力学分析,确定了邻醌的最高吸收光谱和酶测定的适宜参数。这一测定方法与原方法[1]相比,提高了多酚氧化酶测定的准确性、重复性和可比性,使灵敏度提高了5倍。

关　键　词:　改进;多酚氧化酶;动力学曲线

中图分类号:　O946.5 文献标识码:　A 文章编号:　1007-9793(2005)01-0044-02

多份氧化酶(P olyphenol oxidase,PPO)是植物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化酶[2,3],它包括单酚氧化酶[酪氨酸酶(tyrosinase), EC.1.10.3.2]、双氧化酶[儿茶酚氧化酶(catechol oxidase),EC.1.10.3.2]、漆酶(laccase,EC.1.10.3.

1)[4,5]。它可以把酚类物质如单酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为相应的醌类物质[6,7]。醌类物质对病原微生物起着抑制作用或杀伤作用,具有一定的抗病能力。因此,在感病的植物体中,PPO活性都有不同程度的提高,以抵抗病原体进一步侵染健康的植物组织[4,5]。此外,PPO对食品和饮料生产也会产生重大影响,它不仅影响食品和饮料的色泽,也影响其品质,特别是在制作绿茶、红茶、烤烟和水果类饮料的过程中更为突出[8,9]。所以,准确测定PPO活性,具有重要的生理和现实意义。

PPO常用的测定方法有比色法[1]和氧电极法[6],本文通过对比色法的改进,极大地提高了PP0测定的准确性、重现性和可比性,使灵敏度提高了5倍。

1.　材料的准备和处理方法

1.1植物材料的培养和选购

挑选饱满的玉米(Z ea Mays)品种大黄的种子,以0.1%HgCl2消毒10min后,漂洗干净,于26.5℃下吸涨12h,播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘(24cm×16cm)中,于26.5℃下黑暗中萌发60h。随后,于同样的温度下继续培养10天,每天光照16h和不断补充蒸馏水。苗龄为12.5天的玉米幼苗根系作为PPO测定材料。

另一种材料为马铃薯块茎,品种为H-6,购自昆明市种子公司。

1.2酶液的提取

酶液的提取按朱广廉[1]方法。

1.3PPO反应产物吸收光谱分析

马铃薯块茎PPO与底物反应后,加入20%三氯乙酸终止反应。反应产物用UNIC-2000分光光度计于波长400～550nm下每隔2nm测定光密度。

1.4PPO测定反应的动力学分析

马铃薯块茎PPO与底物反应后,在不同时间段检测两个波长410nm和525nm下的光密度。取0～3min时间段,即3min反应时间来计算酶活性,并且用光密度变化0.01个单位所需要的酶液量作为一个活力单位(U)。

2.　结果与分析

PPO与邻苯二酚反应的反应产物邻醌用U2

Ξ收稿日期:2004-04-06

基金项目:国家自然科学基金(3986000),云南省自然科学基金(98C002Z)

作者简介:李忠光(1971-),男(彝族),云南省永德县人,实验师,主要研究方向为植物逆境生物学. 通讯作者:龚　明

NIC-2000分光光度计于波长400～550nm下每隔2nm扫描光密度,得到图1(A)的吸收光谱图。从图1(A)可以看出,邻醌的最大吸收光谱位于蓝紫光区域

,410nm处有最大吸收峰,与文献报道[1]的525nm差异较大。因此,后面的酶活性测定于410nm下进行,反应时间为3min。

　图1苯醌的吸收光谱及PPO反应的动力学曲线

Fig.1Abs orption spectrum of o-quinone and kinetics curve of PPO reaction

PPO与底物反应后,在不同时间段检测两个波长410nm和525nm下的光密度变化,得到图1 (B)。从图中可以看出,PPO酶促反应在0～3 min内呈现很好的线性关系,所以取0～3min时间段,即3min反应时间来计算酶活性。但是,当酶促反应达到10min时,光密度开始下降,即邻醌被还原。因为在反应体系中存在抗坏血酸等抗氧化剂时,邻醌被抗坏血酸还原为邻苯二酚[10]。所以,PPO测定中最好在反应10min内计算酶活性,其中以反应3min为最佳时间。

图2玉米幼苗和马铃薯块茎中PPO活性

Fig.2PPO activities of maize seedlings and potato tuber

为了进一步检验我们这一方法的有效性,我们测定了苗龄为12.5天的玉米幼苗根系和H-6马铃薯块茎的PPO活性,得到图2的结果。从图2可以看出,在波长410nm下测定PPO活性比在525nm下测定PPO活性提高了5倍。

综上所述,这一测定方法提高了PPO活性测定的准确性、重复性和可比性。因此,这一方法是有效可行的。

参　考　文　献:

[1]　朱广廉,钟诲文,张爱琴.植物生理学实验[M].北

京:北京大学出版社,1990.37-40.

[2]　李合生.现代植物生理学[M].北京:高等教育出版

社,2002.66.

[3]　潘瑞炽.植物生理学(第四版)[M].北京:高等教育

出版社,2001.112.

[4]　贺立红,宾金华.高等植物中的多酚氧化酶[J].植物

生理学通讯,2001,37(4):340-345.

[5]　许传俊,李玲.植物多酚氧化酶研究进展[J].2002,6

(1):45-55.

[7]　张志良,瞿伟菁.植物生理学实验指导(第三版)

[M].北京:高等教育出版社,2003.120-121.

[8]　戴亚,施春华,唐宏,等.烟草多酚氧化酶分离提纯及

性质研究[J].中国烟草学报,2001,7(4):7-12. [9]　黄建韶,张洪,田红现.苹果中多酚氧化酶的性质

[J].食品与机械,2001,83:21-22.

[10]　白宝璋,汤学军.植物生理学测试技术[M].北京:

中国科学技术出版社,1993,66-68.

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　第1期 李忠光,等:　植物多酚氧化酶活性测定方法的改进