淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛复筛及酶活力测定

发酵培养基配制说明
三角瓶规格要统一。 先将不溶解的淀粉、豆粕粉、 CaCO3分别 称于500mL三角瓶。 将无机盐称量后先溶解于水中（在1000mL 三角瓶中配制1000mL），调节pH为 7.0~7.5，再用量筒量取100mL分别加于 500mL三角瓶中，轻摇混匀。 121.3℃灭菌20分钟 灭完菌后取出，要马上轻摇混匀（？）。
摇瓶发酵复筛试验的菌种活化 （？）
复筛菌种活化培养时间要求：上课前一天 中午12：45~13：30，斜面菌种接种于 种子培养基（50mL），37℃摇瓶培养。 培养时间：18~24小时
摇瓶发酵复筛试验的安排和步骤
当天上课时间制备发酵培养基（也可以初 筛时一起准备），3~5瓶/株菌 （100mL/瓶），灭菌。 将摇瓶培养好的菌种，用2mL无菌吸管吸 取2mL接种于100mL发酵培养基中（装 于500mL三角瓶）， 37 ℃摇瓶培养 （往复式110转/分钟）3天。 3天后小漏斗脱脂棉花过滤发酵液。 测定发酵液中α-淀粉酶酶活力单位（碘比 色法）。 根据结果可以判断所选菌株产酶能力是否 稳定。
本次实验基本流程
冷却后接种 准备发酵 灭菌 环接种 培养基 （1瓶/株） 恒温摇 瓶培养 发酵液棉 花过滤 测定酶 活力 确定1-2 株复发酵 菌株
一级液体 活化菌种
液体菌种接种 于发酵培养基 （3-5瓶/株） 灭菌 准备发酵 培养基
恒温摇 瓶培养
发酵液棉 花过滤
测定酶 活力
思考题
根据实验过程及结果，体会初筛和复筛的 意义所在？ 根据已完成的实验，认真分析实验结果及 所存在的问题？
摇瓶发酵初筛方法及步骤
发酵培养基灭菌冷却后，利用接种环接种 一环上周培养好的斜面菌种（1瓶/株）。 37 ℃摇瓶培养（往复式，110转/分钟） 3天。 3天后小漏斗加少许脱脂棉花过滤发酵液。 测定发酵液中α-淀粉酶酶活力单位（碘比 色法）——先测原发酵液、低于5min的稀 释后重测（2、5、10倍，控制终点反应时 间为5-10min）。 根据结果选出1~2株进行下周的复筛试验。
பைடு நூலகம்
发酵液处理
发酵液漏斗加棉花过滤； 发酵液稀释10倍； 测定-酶淀粉酶活力单位； 需要2%淀粉溶液3升/25组（ 20×4×25=2000mL），pH6.0缓冲 液1升/25组（5×4×25=500mL）
初筛使用挑取的斜面菌种直接接种（1瓶/ 株）， 37℃，往复摇瓶机110-120转/ 分钟，培养2-3天，斜面菌种继续保藏； 复筛使用的是初筛酶活力最大的菌株，先 液体培养基活化18~24小时（37℃，旋 转摇瓶机100-150转/分钟），接种量 2mL/瓶（3-4瓶/株） ，37℃，往复式 摇瓶机110-120/分钟，培养3天； 同时进行斜面直接接种对照培养（条件同 上）。
初筛接种培养时间
星期二下午班次：星期二（3月19日）16 ：00~16：30； 星期四上午班次：星期四（3月21日）11 ：00~11：30 星期四下午班次：星期四（3月21日）16 ：00~16：30
初筛和复筛试验接种培养测定时间 安排
班次 初筛接种 时间 星期二 16:00 星期四 11:00 星期四 16:00 初筛测定 时间 星期五 8:30 星期六 8:30 星期六 10:30 复筛菌种活 化接种时间
发酵培养基（8瓶/组） （100mL装于500mL三角瓶）
玉米淀粉（可溶性淀粉 ） 1g； 豆粕粉 3g； Na2HPO4 .12H2O 0.8g； （NH4）2SO4 0.4g； NH4Cl 0.15g； CaCO3 0.10g 水100mL 121.3℃灭菌20分钟 初筛和复筛所需要的一起准备配制。
液体接种用种子菌液制备
划线接种斜面，30℃培养7天以上备用 （充分产芽孢）。 复筛试验用： 挑取斜面菌种2环，洗涤于10mL无菌水 中，制成菌悬液备用接种，接种前制备。 正交试验用： 30mL无菌水洗涤斜面（1支），制成菌 悬液备用接种，接种前制备。
其它器材
1mL无菌吸管 10支（本学期不需要准备） 2mL无菌吸管 4支。 分别标记清楚。 10mL无菌水 1支，装于18×180mm试 管（全班统一包扎灭菌）。 30mL无菌水 2瓶装于250mL三角瓶中， 包扎，121.3℃灭菌20分钟备用。
种子培养基 （复筛和正交试验使用）
玉米淀粉（可溶性淀粉） 10g； Na2HPO4 .12H2O 8g； （NH4）2SO4 4g； NH4Cl 1.5g； 3%豆粕粉浸出液 1000mL 煮沸使淀粉溶解后，取50mL分装于 250mL三角瓶（2瓶）包扎；取5mL分装 于18×180mm试管中（7支），加塞包 扎（本学期不使用，不需准备）。 121.3℃灭菌20分钟
目的要求
了解利用微生物摇瓶发酵初筛、复筛的目 的及要求，其基本原理及方法。 了解摇瓶发酵培养的原理、要求和方法技 术。 了解液体摇瓶发酵用培养基的配制要求。 进一步熟悉掌握碘比色法（部颁标准）测 定α -淀粉酶活力的原理和方法步骤。
基本原理
摇瓶培养发酵技术是在抗生素生产的需求 条件下发展而来的——需求增加，规模扩 大，产量增加，调控控制。 浅层培养发酵→深层培养发酵（实验室、 工业生产） 根据用途配制含有适合营养基质的液体培 养基 细胞悬浮于相应液体培养基质中，通过振 荡，细胞得到充分溶解氧，接触较为新鲜 的均匀营养物质，细胞代谢活性较高。
星期五 10:30 星期六 10:30 星期六 12:00
复筛接种 时间
复筛测定 时间
星期二下午
下周星期二 下周星期五 14:00 8:30 下周星期四 下周星期六 8:30 8:30 下周星期四 下周星期六 10:30 10:30 下周
星期四上午
星期四下午
斜面接种于液体三角瓶的步骤 和要求
具体步骤
先将接种环制好（直、环平、环稍小—— 直径小于φ3mm）； 挑取斜面菌种满环（要求各瓶尽量一致， 以第一瓶作为标准）； 无菌操作取下三角瓶瓶布（连同包扎报纸， 拿于手中），将接种环上的菌种涮洗于液 体培养基中（液体培养基中摩擦瓶壁）； 盖瓶布（不要包扎报纸），捆扎好； 放在摇瓶机上（注意不要损坏三角瓶）， 120转/分，37℃往复振荡培养2~3天。