基于ITSrDNA高通量测序方法研究玉米粉碎粒度对奶牛瘤胃真菌菌群的影响

1.4 样品采集与处理 通过牛口腔导管采集瘤 胃液袁采集时间分别为饲喂前 0 h 和饲喂后 2尧4尧 6 h袁每期连续 3 d渊16尧17尧18 d冤取样遥 为获得具有 代表性的样品袁 每天 4 个时间点所取的瘤胃液样 品经混匀后各取 5 mL袁 充分混合装入离心管中袁 放置于-80 益冻存遥 将 3 d 样品混合均匀后取 1.5 mL 用冻存管保存遥 1.5 DNA 样品提取尧扩增和 Miseq 测序 将-80 益 冻存的 8 个瘤胃液样品 4 益溶解袁 轻微颠倒混 匀袁静置 5 min袁取上清液 1 mL 转入 1.5 mL 离心 管中袁 送往广州基迪奥生物科技有限公司进行 DNA 样品提取尧扩增尧纯化尧均一化袁制备 Miseq 文库尧采用 Hiseq2500 PE250 上机测序遥 采用 1% 的琼脂糖凝胶电泳袁 在 100V 恒定电压下袁 电泳 30 min袁采用 NanoDrop 2000 检测提取 DNA 条带 的质量遥 从样本中提取基因组 DNA 后袁 用带有
基金项目院国家自然基金项目野寡糖对奶牛瘤胃纤维降解 影响机制及乳脂下降综合症调控的研究冶渊31460619冤 * 通讯作者
角质层屏障,降解无法被细菌和纤毛虫降解的木 质素纤维物质渊于长青等袁2004曰毛胜勇等袁2000曰 邓凯东袁1998冤遥 瘤胃真菌不仅可以分泌一些纤维 素降解酶袁 而且可以产生 琢-淀粉酶及淀粉葡萄 糖苷酶来降解淀粉渊于常青袁2004冤遥 粉碎粒度会 影响玉米淀粉瘤胃降解速度袁本试验旨在用细粉 碎玉米代替占日粮 10%干物质的破碎玉米袁通过 ITS rDNA 高通量测序技术研究其对奶牛瘤胃真 菌菌群多样性的影响遥 1 材料与方法 1.1 试验动物及饲养管理 选用 4 头体况良好袁 泌乳 20 d 左右袁 日产奶量大约为 30 kg袁 体重 渊550依35冤kg 的经产渊二胎冤中国荷斯坦奶牛为试 验动物遥 试验奶牛采用 TMR 饲喂方式遥 1.2 试验日粮 根据 NRC渊2001冤奶牛饲养标准 配制日粮袁日粮组成和营养成分见表 1遥 1.3 试验设计 采用 2伊2 交叉试验设计袁对照组 奶牛日粮添加 10%的破碎玉米遥 试验组由细粉碎 玉米代替该比例破碎玉米袁每个阶段试验期为 21 d袁预饲期 14 d袁正试期 7 d遥
[摘要] 本试验利用 ITS 高通量测序技术研究玉米粉碎粒度对泌乳早期奶牛真菌菌群的影响遥 选用 4 头体况良
好袁泌乳 20 d 左右袁日产奶量约 30 kg袁体重 550 kg 左右经产中国荷斯坦奶牛遥 试验采用 2伊2 交叉试验设计袁对照组
奶牛日粮添加 10%的破碎玉米袁试验组是将该比例破碎玉米由细粉碎玉米代替遥 结果表明院用细粉碎玉米替代破碎玉
米渊10%DM冤并未显著影响奶牛瘤胃真菌的多样性与丰富度遥 在门水平上袁试验组与对照组瘤胃真菌丰度差异不显
著曰在属水平上袁德巴利酵母属与蜡孔属等优势菌属有较大幅度的下降袁但差异不显著渊P > 0.05冤袁这可能与奶牛个体
差异有关遥 而与淀粉降解有关的根囊鞭菌属的菌群丰度显著升高渊P < 0.05冤遥 其他相对丰度较低的真菌也有检出袁如
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中国饲料
2019 年第 15 期
Fra Baidu bibliotek
表 1 奶牛试验日粮组成及营养成分
项目 日粮组成 苜蓿干草/% 羊草/% 玉米青贮/% 蒸汽压片玉米/% 玉米渊破碎冤/% 玉米渊细粉碎冤/% 豆粕/% 胡麻饼/% 麦麸/% 全棉籽/% 甜菜颗粒/% 脂肪酸钙/% 预混料/% 磷酸氢钙/% 食盐/% 碳酸氢钠/% 氧化镁/% 营养水平 粗蛋白质/% 产奶净能/渊MJ/kg冤 中性洗涤纤维/% 酸性洗涤纤维/%
试验组柄孢壳属渊Zopfiella冤与被孢霉属渊Mortierella冤增加明显渊P < 0.05冤袁但其在瘤胃的功能目前尚鲜见报道遥
[关键词] ITS 高通量测序技术曰 中国荷斯坦奶牛曰 玉米粉碎粒度曰 瘤胃真菌菌群
[中图分类号] S811.6
[文献标识码] A
[文章编号] 1004-3314渊2019冤15-0015-05
barcode 的特异引物扩增 ITS rDNA 的 ITS2 区遥 引 物 设 计 渊F院GCATCGATGAAGAACGCAGC曰R院 ATATGTAGGATGAAGAACGYAGYRAA冤遥 然 后 PCR 扩增产物切胶回收袁 用 QuantiFluorTM 荧光 计进行定量遥 将纯化的扩增产物进行等量混合袁 连接测序接头袁 构建测序文库袁 最终利用 Hiseq2500 PE250 上机测序遥 1.6 数据处理与分析 数据经 Excel 初步整理 后袁 采用 SAS 8.2 中两阶段交叉设计的方差分析 对数据进行分析袁采用最小显著法 LSD 进行差异 显著性比较袁 以 P 约 0.05 作为差异显著性判断标 准袁结果以野平均数依标准误冶表示遥 2 结果与分析 2.1 样品 OTU 分布 为获得样品中物种的多样 性信息袁 首先对 tags 进行 OTU 渊Operating Taxo鄄 nomic Unit冤聚类袁利用 Mothur渊v.1.34.0冤计算 0.03 距离下渊97%的相似度冤的 OTU 数量遥 由图 1 可以 看出袁 试验组的 OTU 为 258袁 对照组的 OTU 为 229袁其中两组共有的 OTU 为 105袁试验组单独有 的 OTU 为 153袁 对照组单独拥有的 OTU 为 124袁 从总体数量来看袁 试验组的 OTU 数量多于对照 组袁但差异不显著渊P > 0.05冤遥
2019 年第 15 期
中国饲料
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科学实验研究 DOI院10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20191504
基于 ITS rDNA 高通量测序方法研究玉米 粉碎粒度对奶牛瘤胃真菌菌群的影响
吉武龙袁 郭 成袁 胡丹丹袁 张力莉袁 徐晓锋 *
渊宁夏大学农学院袁宁夏银川 750021冤
瘤胃中的微生物是反刍动物进行消化的主 要执行者袁在反刍动物的消化过程中承担了非常 重要的角色遥 瘤胃真菌在瘤胃微生物中占 8% ~ 20%袁在纤维降解的过程中起到了极其重要的作 用渊Edwards 等袁2017冤遥瘤胃真菌能分泌一些高活 性的酶袁包括纤维素酶尧半纤维素酶尧木聚糖酶尧 半乳糖醛酸酶等 13 种酶渊雷威等袁2005冤遥 目前从 瘤胃中分离得到的真菌共计 5 个属十余个种袁其 有溶解纤维的特性袁并且都具有降解植物细胞壁 中结构性碳水化合物的能力 渊于长青等袁2004冤遥 瘤胃真菌的数量随日粮纤维含量的变化而变化院 日粮中粗饲料含量较高时袁瘤胃中真菌数量也较 高曰相反袁日粮中淀粉或谷物含量较高时袁则真菌 数量较少渊邓凯东袁1998冤遥 瘤胃真菌不仅可以通 过纤维素酶来降解纤维素袁还可以通过物理方式 降解纤维素袁主要是从孢子囊中释放出的游动孢 子可游动到易于集聚的植物组织部位袁穿透牧草
钙/% 磷/%
对照组
18 3 29 5 10
12 6 5 3 3 2 0.8 0.5 0.5 1.2 0.2
18.66 6.87 31.7 20.1 0.9 0.5
试验组
18 3 29 5
10 12 6 5 3 3 2 0.8 0.5 0.5 1.2 0.2
18.66 6.87 31.7 20.1 0.9 0.5