色谱分析 (上海交通大学课件)【PPT】课件

检测器
记录系统
进样系统
进样器
填充柱色谱常用10μL 毛细管色谱常用1μL 全自动液体进样器
气化室
将液体试样瞬间气化的装置
自动进样器
Combi Pal 三合一装置 顶空加热装置
控制面板
进样方式
液体直接进样
静态顶空萃取
利用被测样品（气-液和气-固）加热平衡后，取其 挥发气体部分进入气相色谱仪分析。
1906年茨维特
创 建 重 ：颜色 色 色
谱：图谱 现 谱
论文发表
色谱法分离过程
本 质：
混 合 物 分 离
载气 固定液
两相
流动相石油醚 液相 石油醚 固定相 CaCO 固相 CaCO33
色谱分离法的原理？？？
迁移
12.1 色谱法分类 色谱法分类
气体 流 动 相 超临界
气 相 色 谱 液 相 色 谱
检测器-FID
原理
（1）含碳物质氢火焰中离子化 （2）外电场作用形成电流, 与 待测物质量正比
适用范围
（1）检测含碳有机化合物更通用 （2）无机气体、水、四氯化碳等含氢 少或不含氢的物质灵敏度低或不响应
气相色谱法的应用
定性分析 确定每个色谱峰代表何种物质
定量分析 利用气相色谱的检测信号峰高或峰面积，进行定量和半定量分析
泵 色谱图 色谱柱
检测器
溶剂
高压输液泵
装有高分子膜 的真空容器。 溶解气体的分 子尺寸较小， 与高分子膜有 更强的亲和力。
溶剂柜
真空脱气机 G1322A
只有一个泵，配 有比例阀，能够 在不同时间吸取 不同溶剂
四元泵 G1311A
手动进样器
六通阀与定量环
自动进样器
样品盘 机械手
自动进样100样品盘/机器手/自动洗针
实验注意事项-色谱柱
尽量用自己的色谱柱-防止相互污染
连接色谱柱时，应注意连接方向，防止反接、反冲色谱柱。
每次实验结束时，应使色谱柱内充满纯有机溶剂。
实验注意事项-流动相
HPLC流动相的所有溶剂至少需经过G4砂芯漏斗的过滤， 且需要超声脱气
HPLC流动相的溶剂至少应为HPLC级/色谱级并与填料相 匹配，水应为高纯水（在夏季应每天更换） 严禁长时间以纯水作为流动相 最好用流动相溶样
填充柱色谱 毛细管色谱 分配色谱
液体
离子色谱
排阻色谱等
色谱法的优点
分离效率高 检测灵敏度高
多组分、复杂样品的测定 应用范围广：生命/药物食品/环境
提纲
色谱的基本概念
气相色谱
液相色谱
仪器结构及原理
载气系统 进样系统
色谱柱
气相色谱分析流程示意图 1 – 载气钢瓶； 2 – 减压阀； 3 – 干燥管； 4 – 针形阀； 5 – 流量计； 6 – 压力表； 7 – 进样器； 9 – 色谱室； 10 – 检测器； 11 – 记录仪
固相微萃取
色谱柱
过 去 时
填充柱
内径粗 3-5mm
柱长 1-3m/常用不锈钢
内径细 0.2-0.5mm
柱长 20-100m/常用石英
现 在 时
毛细管柱(开管柱)
毛细管色谱柱的特点
主要为开管柱 open tubular column 管内壁涂渍固定液，无载体空心管 主 分离能力强 适用更复杂对象 要 特 分析时间快 高载气流速 点 柱容量小 进样量小/分流 目 前 的 主 流 GC
主要影响因素3-分流比
问什么要采用分流技术？
分流比的定义？
气相色谱常见问题
气相色谱常见问题
沸点低，<350oC,易挥 发，热稳定 确定待测样是否符合GC要求 实验注意事项
浓度尽可能低：小于10ppm
待测样不能含有水份(特殊柱：水样) 溶剂沸点尽可能低，尽量不选用丙酮 柱温要低于固定液使用温度 样品必须经过0.45μm或0.22μm的滤膜过滤
建立液相色谱法的步骤3-流动相（反相）
甲醇-水的比例？？？
流动相的流速？？？
液相色谱法的常见问题
液相色谱法的常见问题
实验注意事项-样品
进样前，必须检测样品pH值，允许范围2~7 进HPLC的样品需要严格控制样品的浓度范围，防止系统污 染及平头峰的出现。 样品必须经过0.45μm或0.22μm的滤膜过滤
0.001-0.1
2-20
2-50 2×105-5×104 1-10 1-20 10-6-10-2 0.05-1.0
液相色谱的应用-环保方面
1、农药残留量分析 ：含氯农药 、有机磷 农药 、除虫菊等 2、致癌物质 ：硝基呋喃及其代谢物、霉 素 、亚硝胺、苯并芘等 3、水质分析：内分泌污染物等 4、其它……
Байду номын сангаас
液相色谱的应用-生命方面
1、蛋白质分析 2、肽类的分析 3、核酸 4、氨基酸 5、其它……
液相色谱的应用-医药方面
1、新药研发：目标物的检测、纯度等 2、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等 3、体液：血、尿、脊椎液、唾液等 4、抗菌素 ：青霉素 、甾族(激素)等 5、其它……
仪器结构
进样口
混合器
色谱分析
教师：柴晓兰 2009.9.27
自我介绍
2008年毕业于上海交通大学（博士）
研究方向
复杂样品中痕量组分的色谱分析
样品前处理技术-固相微萃取 分析化学教研室
日常工作
创新实践基地
提纲
色谱的基本概念
气相色谱
液相色谱
色谱法概述
1903年 1903 俄罗斯植物学家 Tsweet茨维特 植物提取液 CaCO3玻璃柱 石油醚淋洗
8 3 4 5 6 Minutes
90
4.298
mVolts
3.445
乙苯/对间/邻二甲苯
80
70
只有3峰
2.697 5.476 5.608 5.981
60
50
40
30
30m×0.25mm×0.25um
20
10 3 4 5 6 Minutes
建立方法的步骤3-载气流速
由图可见存在最佳流速（uopt）。实际流速通 常稍大于最佳流速，以缩短分析时间。
建立液相色谱法的一般步骤
建立液相色谱法的步骤1
正相HPLC
极性:固定相 > 流动相
固定相 - 极性强 流动相(己烷, 庚烷)- 极性弱
极性物质后出峰
主流 反相HPLC
极性:固定相 < 流动相 固定相 - 极性弱 流动相(甲醇, 乙腈等)- 极性强 极性小物质后出峰 与固定相
极性相近
tR长
色谱柱的类型及适用范围 建立液相色谱法的步骤2-色谱柱
MSD mass spectrum detector
电子捕获检测器
质谱检测器
ECD electron capture detector
TCD检测器
构造
纯载气
热敏电阻丝R参
热敏电阻丝R测
载气+组份
参比池
测量池
热敏电阻 不同气体的热扩散作用改变电阻 “万能”检测器，但是灵敏度低 常用于填充柱和浓度较大时
气相色谱定性分析
色 谱 纯标准样对照 自 身高法找人！ 身 定 性 文献值对照
保留值 标样加入 双柱定性 相对保留值 保留指数 GC-MS GC-NIR
保 流行中！ 留 值 仪器联用定性
—
气相色谱定量分析
定量依据：组分含量与峰面积成正比 归一化法定量 定量分析方法 外标法定量 内标法定量
归一化法定量
谢 今 谢 日 各 关 色谱分离的本质和原理 位 键 气相色谱的仪器结构与实验注意事项 ！ 词
液相色谱的仪器结构与方法建立
类型 烷基C8 烷基C18 苯基 芳硝基 氰基 性质 非极性 非极性 非极性 弱极性 极性 色谱分离方式 反相、离子对 反相、离子对 反相 反相或正相 正相（反相）
氨基
极性
正相（反相、阴离子交换）
建立液相色谱法的步骤3-流动相（反相）
常用溶剂：乙腈、甲醇、水等
实际使用：甲醇-水/乙腈-水混合体系
等度洗脱：流动相比例恒定 梯度洗脱：逐步提高有机溶剂比例
提纲
色谱的基本概念
气相色谱
液相色谱
GC与LC的比较
检测器不同
测定对象拓展
LC与HPLC的比较
项目 色谱柱柱长/cm 色谱柱柱内径/mm 固定相粒度：粒径/μm LC 10-200 10-50 75-600 HPLC 10-25 3-5 5-50
色谱柱入口压力/Mpa
色谱柱柱效/(理论塔板数/m) 进样量/g 分析时间/h
色谱柱
柱温箱
外挂架
检测器
钨灯 耦合透镜 氘灯
光源透镜 (消色差透镜)
阵列 支撑透镜
氧化钬滤光片
光谱透镜
ＤＡＤ检测器
Flow cell 狭缝 光栅
UV/Vis双灯，全波长检测，需选择目标分析物的特征波长即可，兼顾强度与噪声水平
其他检测器
MSD
化学工作站
数据处理
进样器
高压泵 流动相
色谱柱 检测器
建立方法的步骤2-固定相的性质
商品名: HP-INNOWax
4.099
mVolts
3.218
100
乙苯/对/间/邻二甲苯
聚乙二醇: 极性强 30m×0.25mm×0.25um
75
分成4峰
2.913 5.113 5.217 5.308 5.770 5.982
50
25
固定液 极性
商品名: HP-1 二甲基聚硅氧烷: 弱极性
100
(f
i 1
n
100
' i
Aj)
特点及要求： § 简便、准确 § 进样量/操作条件对结果影响不大(同时) § 试样中所有组分必须全出峰
内标法定量
常用定量方法
目的:为消除进样量、操作条件对色谱定量的影响
方法:定量地将内标准物质加入试样中并混匀
内标物要满足以下要求： 试样中无 不与待测组分反应 与被测组分性质相似 峰邻近又较好分离
外标法定量
常用定量方法
方法: 已知浓度标准系列作工作曲线 要求:进样量和分离操作条件必须相同
0.8 y = 0.3617x + 0.0034 R 0.6
2
= 0.9994
0.4
0.2
0.0 0 0.5 1 1.5 2
建立方法的步骤1-选择检测器
热导检测器
TCD thermal conductivity detector
实验注意事项-流动相
缓冲液的pH值，在填料的允许范围（一般为pH2-8）内 若需要使用缓冲液，也应控制浓度，一般使用0.1%的磷酸或 甲酸溶液。 每次使用缓冲液后，需先使用大量水冲洗管路，再用纯有机 溶剂长时间冲洗管路及色谱柱，以免对系统造成腐蚀。 做样前和做样后要记录柱压，确保要基本一致。
总结
原因:不同检测器对不同组分的灵敏度不同
自身测得,受条件影响
定 量 校 正 因 子
绝对校正因子
fi
mi Ai
m i f i Ai
相对校正因子
相对某种标准物/便于比较
f i
fi fs
测量f ’常用标准物:苯(TCD), 正庚烷（FID)
归一化法定量
f i Ai
'
%i
mi m1 m 2 m j
H A dH du uopt B u B u
2
C u C 0
B C
建立方法的步骤4-温度选择
气化室 检测器 色谱柱 保证液体试样瞬间气化；
保证被分离后的组分通过时不在此冷凝；
低于固定液使用温度
低于组分沸点 能低则低！
准确控制分离需要的 温度。当试样复杂时， 分离室温度需要按一定 程序控制温度变化，各 组分在最佳温度下分离；
分流技术
原因：柱容量小 毛细管柱进样量必 须极小（一般液样 10-2～10-3微升，气 样约1微升） 分流比常20:1
何时不用分流？
检测器
热导检测器
TCD thermal conductivity detector
FPD flame photometric detector 火焰光度检测器
氢火焰离子检测器 FID hydrogen flame ionization detector
FPD flame photometric detector 火焰光度检测器
氢火焰离子检测器 FID hydrogen flame ionization detector
MSD mass spectrum detector
电子捕获检测器
质谱检测器
ECD electron capture detector