模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
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基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定 点突变、基因插入\缺失、基因置换等，再按组成顺序 构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具 有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能， 以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响 等方面的内容。 与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
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在这个网页里可以从上面的一 些文字得到常用中间引物的序 列，在下面的输入框里输入 SALK_151561.52.85.n号 后，即可得到左侧和右侧的引 物：
也即：SALK_151561.52.85.n PRODUCT_SIZE 1170 PAIR_ANY_COMPL 0.00 PAIR_3'_COMPL 0.00 DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55 3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55 3'_COMPL 0.00 Insertion chr1 25983634 BP+RP_PRODUCT_SIZE 610-910
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三.琼脂糖凝胶电泳
1.用0.5XTBE电泳缓冲液配置1％琼脂糖凝胶； 2.在15uL PCR产物中加3uL上样缓冲液(6x)点样于1% 琼脂 糖胶上电泳, 稳压100Ｖ（5Ｖ/cm）； 3.电泳结束，溴化乙锭染色5分钟（如果电泳凝胶中不含溴 化乙锭）；
4.在紫外灯下或用凝胶成像仪观察、拍照，然后分析条带。
2012.11.28
实验材料
拟南芥又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传 学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物， 其原因主要基于该植物具有以下特点： 植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右； 种子多，每株每代可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培 养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯 合，用理化因素处理突变率很高，容 易获得各种代谢功能的缺陷型。
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拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的
培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
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图片
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AT1G69120基因
AT1G69120基因即APETALA1，已有实验证明 AT1G69120是拟南芥花分生组织特征基因。 研究AT1G69120在花发育中的网络调控及其生物学 功能。 获得插入T-DNA的APETALA1突变体。 利用反向遗传学方法进行研究。 通过对突变体的突变性状与野生型拟南芥生长发育以及 生理特征进行比较，可以获得拟南芥AT1G69120基因 影响生物生理功能的相关信息。
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二.PCR反应（变性--退火--延伸）
1. 按如下方法配制PCR反应体系（管上应写明株号）： 10xTaq buffer（Mg2+ free） 2ul MgCl2 2ul 某株号模板DNA 2ul 引物LP 0.5ul 引物RP 0.5ul 引物BP 0.5ul dNTP 0.5ul Taq酶 0.2ul H2 O 11.8ul 总体积 20ul 2. PCR程序：94℃变性5min； 94℃变性40s，53℃复性50s， 72℃延伸80s，共35个循环；72℃最终延伸10min；10℃保持。 3. PCR结束以后，将样品拿出，检查管上的标号是否清晰， 电泳检查结果。
3.用氯仿-异戊醇除去组织匀浆中的变性蛋白质，如
需要百度文库可以用RNase去除RNA。 4.用乙醇或异丙醇沉淀DNA。
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提取植物DNA的步骤
1. 从某植株上取2个幼嫩叶片，置于一个1.5 ml离心管中， 放于试管架上，加入液氮，用研棒研磨成细粉，加入600 μ L的2×CTAB提取液，轻摇混匀。 2. 65℃水浴0.5 h，其间轻摇混匀。 3. 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下 轻轻混匀10 min，然后12000 rpm离心15 min，再转移上 清入新管中。 4. 向上清液中加2倍体积的无水乙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心15 min，弃上清。 5. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 6. 将沉淀再空气中晾干10 min或37 ℃ 烘箱中3-4 min。加 20 μ L TE (pH 8.0)室温溶解。-20 ℃保存。
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图片
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拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
一.提取植物DNA；
二.PCR反应；
三.琼脂糖凝胶电泳；
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一.提取植物基因组的过程
1.植物细胞具有细胞壁，提取植物DNA首先要在液氮 中将新鲜或冷冻的植物组织研磨成粉，使细胞壁破裂。 2.加入含去污剂（如SDS、CTAB等）、螯合剂EDTA等 成份的提取缓冲液，处理组织匀浆。去污剂裂解细胞 膜，变性蛋白，使DNA释放到提取液中；EDTA则能与 DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，而不 能降解从核中释放的DNA。
点击上面红圆圈内的 SALK_151561.52.85.n 可以从上面找到T-DNA的 侧翼序列、所有的载体序列 以及订购方式等。
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查找种子
打开 NASChttp://www. arabidopsis.info/ 打开的页面如下：
输入上面选择的 SALK_151561.52. 85.n，寻找合适的种子 序号：N57925
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拟南芥突变体的获得
打开NCBI主页： http://www.ncbi.nl m.nih.gov/ 打开的页面如下： 在上面的search内查找 基因名称APETALA1：
从上面可以看到一共有19 个结果，其中第一个是拟 南芥中的，点击AP1：
根据上面的信息我们可以 得到基因在拟南芥内的系 统名称：AT1G69120
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突变体的获得
插入诱变（insertional mutagenesis），即将外源DNA随机插
入到拟南芥基因组中，获得突变体。 当外源DNA“击中”某一基因时，这个特定基因就被关闭。
农杆菌转化法：
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农 杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA 中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。根据这一现象， 将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，可通过农杆 菌 侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用 农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
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模式植物拟南芥
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组 （n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色 体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科 学家就可以准确定位插入DNA的位置。
现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向 全世界的科研人员开放。研究一个特定基因的研究人员 可以迅速、便利地在种子文库中搜索该基因被关闭的拟 南芥品系，然后向拟南芥生物资源中心订购。
模式植物拟南芥T-DNA插 入突变体的鉴定
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目录
实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体 的PCR鉴定
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实验设计的思路和原理
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研
究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的
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查找基因AT1G69120
打开SALK主页： http://signal.salk. edu/ 打开的页面如下： 点击T-DNA Express：
输入基因名称 AT1G69120，点击 search：
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查找基因AT1G69120
从上述窗口中可以获得很多 不同的突变体，专找 SALK_冠名的那些，获得 比较方便且便宜，有利于插 入突变体。比如选择的是 SALK_151561.52.85.n
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突变体引物查询
进入SIGnAL网站 http://signal.salk. edu/ 打开的页面如下： 点击iSect Tools进入:
点击第一个选项 1、 SIGnAL T-DNA Verification Primer Design进入
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突变体引物查询
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在这个网页里可以从上面的一 些文字得到常用中间引物的序 列，在下面的输入框里输入 SALK_151561.52.85.n号 后，即可得到左侧和右侧的引 物：
也即：SALK_151561.52.85.n PRODUCT_SIZE 1170 PAIR_ANY_COMPL 0.00 PAIR_3'_COMPL 0.00 DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55 3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55 3'_COMPL 0.00 Insertion chr1 25983634 BP+RP_PRODUCT_SIZE 610-910
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三.琼脂糖凝胶电泳
1.用0.5XTBE电泳缓冲液配置1％琼脂糖凝胶； 2.在15uL PCR产物中加3uL上样缓冲液(6x)点样于1% 琼脂 糖胶上电泳, 稳压100Ｖ（5Ｖ/cm）； 3.电泳结束，溴化乙锭染色5分钟（如果电泳凝胶中不含溴 化乙锭）；
4.在紫外灯下或用凝胶成像仪观察、拍照，然后分析条带。
2012.11.28
实验材料
拟南芥又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传 学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物， 其原因主要基于该植物具有以下特点： 植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右； 种子多，每株每代可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培 养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯 合，用理化因素处理突变率很高，容 易获得各种代谢功能的缺陷型。
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拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的
培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
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AT1G69120基因
AT1G69120基因即APETALA1，已有实验证明 AT1G69120是拟南芥花分生组织特征基因。 研究AT1G69120在花发育中的网络调控及其生物学 功能。 获得插入T-DNA的APETALA1突变体。 利用反向遗传学方法进行研究。 通过对突变体的突变性状与野生型拟南芥生长发育以及 生理特征进行比较，可以获得拟南芥AT1G69120基因 影响生物生理功能的相关信息。
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二.PCR反应（变性--退火--延伸）
1. 按如下方法配制PCR反应体系（管上应写明株号）： 10xTaq buffer（Mg2+ free） 2ul MgCl2 2ul 某株号模板DNA 2ul 引物LP 0.5ul 引物RP 0.5ul 引物BP 0.5ul dNTP 0.5ul Taq酶 0.2ul H2 O 11.8ul 总体积 20ul 2. PCR程序：94℃变性5min； 94℃变性40s，53℃复性50s， 72℃延伸80s，共35个循环；72℃最终延伸10min；10℃保持。 3. PCR结束以后，将样品拿出，检查管上的标号是否清晰， 电泳检查结果。
3.用氯仿-异戊醇除去组织匀浆中的变性蛋白质，如
需要百度文库可以用RNase去除RNA。 4.用乙醇或异丙醇沉淀DNA。
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提取植物DNA的步骤
1. 从某植株上取2个幼嫩叶片，置于一个1.5 ml离心管中， 放于试管架上，加入液氮，用研棒研磨成细粉，加入600 μ L的2×CTAB提取液，轻摇混匀。 2. 65℃水浴0.5 h，其间轻摇混匀。 3. 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下 轻轻混匀10 min，然后12000 rpm离心15 min，再转移上 清入新管中。 4. 向上清液中加2倍体积的无水乙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心15 min，弃上清。 5. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 6. 将沉淀再空气中晾干10 min或37 ℃ 烘箱中3-4 min。加 20 μ L TE (pH 8.0)室温溶解。-20 ℃保存。
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拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
一.提取植物DNA；
二.PCR反应；
三.琼脂糖凝胶电泳；
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一.提取植物基因组的过程
1.植物细胞具有细胞壁，提取植物DNA首先要在液氮 中将新鲜或冷冻的植物组织研磨成粉，使细胞壁破裂。 2.加入含去污剂（如SDS、CTAB等）、螯合剂EDTA等 成份的提取缓冲液，处理组织匀浆。去污剂裂解细胞 膜，变性蛋白，使DNA释放到提取液中；EDTA则能与 DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，而不 能降解从核中释放的DNA。
点击上面红圆圈内的 SALK_151561.52.85.n 可以从上面找到T-DNA的 侧翼序列、所有的载体序列 以及订购方式等。
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查找种子
打开 NASChttp://www. arabidopsis.info/ 打开的页面如下：
输入上面选择的 SALK_151561.52. 85.n，寻找合适的种子 序号：N57925
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拟南芥突变体的获得
打开NCBI主页： http://www.ncbi.nl m.nih.gov/ 打开的页面如下： 在上面的search内查找 基因名称APETALA1：
从上面可以看到一共有19 个结果，其中第一个是拟 南芥中的，点击AP1：
根据上面的信息我们可以 得到基因在拟南芥内的系 统名称：AT1G69120
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突变体的获得
插入诱变（insertional mutagenesis），即将外源DNA随机插
入到拟南芥基因组中，获得突变体。 当外源DNA“击中”某一基因时，这个特定基因就被关闭。
农杆菌转化法：
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农 杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA 中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。根据这一现象， 将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，可通过农杆 菌 侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用 农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
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模式植物拟南芥
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组 （n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色 体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科 学家就可以准确定位插入DNA的位置。
现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向 全世界的科研人员开放。研究一个特定基因的研究人员 可以迅速、便利地在种子文库中搜索该基因被关闭的拟 南芥品系，然后向拟南芥生物资源中心订购。
模式植物拟南芥T-DNA插 入突变体的鉴定
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实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体 的PCR鉴定
2012.11.28
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实验设计的思路和原理
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研
究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的
2012.11.28 7
查找基因AT1G69120
打开SALK主页： http://signal.salk. edu/ 打开的页面如下： 点击T-DNA Express：
输入基因名称 AT1G69120，点击 search：
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查找基因AT1G69120
从上述窗口中可以获得很多 不同的突变体，专找 SALK_冠名的那些，获得 比较方便且便宜，有利于插 入突变体。比如选择的是 SALK_151561.52.85.n
2012.11.28
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突变体引物查询
进入SIGnAL网站 http://signal.salk. edu/ 打开的页面如下： 点击iSect Tools进入:
点击第一个选项 1、 SIGnAL T-DNA Verification Primer Design进入
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