去内毒素大量提取

一般来说到了这一步大 提就结束了！但~有客户 会要求浓度为1ug/ul而 又达不到，所以就有了 下一步
浓缩
水 TE
• 1：转移产物至一新离心管中， 加入1/10体积的NaAc、7/10异 丙醇，混匀 -80℃静置2H • 2：12000rpm 20min 弃上清 • 3：加入1ml70%乙醇 12000rpm 15min 弃上清 • 4：放入37℃培养箱至干燥 • 5：加入适量的TE（水）洗脱
管中
• 6：加入1/3倍体积的 E4 颠倒混匀8~10次 • 7：将20ml产物倒入到离心柱中 入离心柱中重复操作 • 8：加入15ml E5 • 10：空离 4000rpm 3min 15min 离心柱开盖室温放置15min 4000rpm 3min 弃废液将剩余产物倒
• 9：加入15ml PW2 4000rpm 3min
去内毒素大量提取
前言：
• 去内毒素大量提取的理论基础为：碱式裂解法！针对实验目的的 不同进行优化而成。 • 而去内毒素大量提取主要针对下游实验中的细胞转染时保证质粒 内不会因为细胞对质粒产生实验目的外的排异反应。尽可能避免 实验假阳性的情况出现。
• One day:
质粒
菌
稀释10倍后点鉴定 测浓度后稀释至 ~1ng/ul
直接利用引物 部的离心式干 燥机进行浓缩
需利用化学试 剂进行浓缩直 接浓缩将会导 致His-Hcl的ph发 生变化
by：罗海琪
水乙醇。离心柱加入5ml激活液 静置30min后 4000rpm离心5min • 1：用50ml管分2次沉菌100ml • 2：加入10ml SI 菌液完全重悬 • 3：加入15ml（10ml） SII 轻轻颠倒10次 静置2min 每次4000rpm 10min 弃上清用纸吸尽残液
• 4：加入21ml（14ml） SIII 颠倒15次
选择合适的感受态 进行转化
分辨抗性后 划线
• 上午
检查平板生长情况挑取2-3个 单菌落
在摇菌管内能清晰的见到菌丝（生长 期内）时用移液枪将200ul菌液移至 2mlEP管内放置于4℃保存其余菌液继 续摇
• 下午
（在小提的同时将上午放置 在4℃的菌液加入到新鲜带 正确抗性的培养基中）确定 菌液后将确认扩大培养的菌 液以1：200扩大培养 在菌液达到平台期后，进行质粒小 提。在提取后若客户提供质粒用原 样作为对照若为菌液则以鉴定胶图 同等高度为准 注：在扩大培养前（即上午）需灭菌：500ml锥形瓶、 下午：在经过30min灭菌的超洁台中加入正确的抗生素至无抗 培养基中再倒入锥形瓶中。（该操作注意加入抗生素前污 染！）
•
6：加入0.1倍体积 ETR 颠倒7~10次 于冰浴（4℃）10-20min后 42℃水浴5-10min后 4000rpm 5min
此时管底会出现蓝色沉淀（若有悬浮室温静置5-10min） • • • • • • • • 7：将上清转移至一新50ml管中加入 0.5倍 无水乙醇 轻轻颠倒5-6次 静置2min 8：将20ml产物倒入到离心柱中 9：加入10 HBC 4000rpm 3min 10：加入15ml DNA wash Buffer 4000rpm 3min 11：加入10ml DNA wash Buffer 4000rpm 3min 12：空离 4000rpm 15min 13：将离心柱转移至一新的50ml管内 14：加入 TE（水） 1ml 静置5min 4000rpm 5min（可选：加入 TE（水）1ml 静置5min 4000rpm 5min） 4000rpm 3min 弃废液将剩余产物倒入离心柱中重复操作
4000rpm • 11：将离心柱转移至一新的50ml管内 • 12：加入0.8ml TE（水） 静置5min 4000rpm 5min（可选：加入 TE（水）0.4ml 静置5min 4000rpm 5min）
•
实验前准备：50ml管一盒（灭菌后）、SI加入RNA酶放置ຫໍສະໝຸດ Baidu4℃、N3、ETR放置于4℃、离心柱加入3ml 4000rpm 3min HBC 加入异丙醇 DNA wash Buffer 加入 无水乙醇 每次4000rpm 10min 弃上清用纸吸尽残液
• 5：将20ml产物倒入到离心柱中静置5min 入离心柱中重复操作 • 6：加入Box Buffer 5ml 静置10min • 7：加入15ml • 8：加入15ml • 9：空离 WA WB 4000rpm 4000rpm 15min
静置2min后 4000rpm
30min
4000rpm 3min 弃废液将剩余产物倒
4000rpm 3min
3min 3min 重复两次
4000rpm
• 10：将离心柱转移至一新的50ml管内 • 11：加入TE（水） 1.2ml 静置5min 4000rpm 5min（可选：加入 TE（水）1ml 静置5min 4000rpm 5min）
• 实验前准备：50ml管一盒（灭菌后）、E1加入RNA酶后放置于4℃、PW2加入适量的无水乙醇、 • 1：用50ml管分2次沉菌100ml • 2：加入10ml E1 菌液完全重悬 • 3：加入10ml E2 轻轻颠倒6~8次。室温放置2min 期间偶尔颠倒2~3次 • 4：加入10ml E3 颠倒10~15次 4000rpm 5min • 5：取出注射器活塞将上清倒入注射器中针口对准新的50ml管，推活塞将裂解液过滤到50ml离心 每次4000rpm 10min 弃上清用纸吸尽残液
GPS 放置4min • • • • •
1：用50ml管分2次沉菌100ml
2：加入10ml SI 菌液完全重悬 3：加入10ml SI 轻轻颠倒10~15次 4：加入5ml N3 颠倒10~15次 离心 4000rpm 10min
5：取出注射器活塞将上清倒入注射器中针口对准新的50ml管，推活塞将裂解液过滤到50ml离心管中
放置于37℃摇床中以250rpm 摇
在摇床摇16-18H后在200ml 菌液中抽取2ml菌液进行小 提
完成小提后与原样或小提质 粒跑鉴定作为对比 结果一样后前期工作就准备 完成了!
艾基生物（我们自行研制）
Magen（美基）
OMEGA
• 实验前准备：50ml管一盒（灭菌后）、SI加入RNA酶后放置于4℃、SIII放置于4℃、WB加入无