多酚氧化酶活性测定及控制[开题报告]

毕业论文开题报告
生物工程
多酚氧化酶活性测定及控制
一、选题的背景、意义
多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。

本研究就PPO的活性和影响该酶作用的因素进行阐述，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。

二、相关研究的最新成果及动态
2.1鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化
从鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀，DEAE-SepH-Arose离子交换柱层析以及PHenyl SepHArose 6FAsT Flow疏水柱层析进行纯化后，经SDS-PAGE电泳确定为单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。

在整个过程中，该酶纯化了95．66倍，产率为2．4％。

同时研究表明，鲜切莲藕组织中PPO相对分子质量在65 900～66 100之间。

2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较
以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测PPO活性极显著相关,邻苯二酚所测活性强,但酪氨酸所测活性的变异系数大。

面粉PPO活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强,但籽粒和全麦粉中的PPO活性高,变异系数大。

2.3 PPO活性与小麦粉主要理化指标的关系
PPO活性与小麦粉白度成极显著负相关性,与灰分含量成极显著正相关性;前路粉流PPO 活性比后路粉流低;物料含皮较多的在线粉流PPO活性高;物料来源于小麦胚乳外层的粉流PPO活性高。

2.4 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制
在抑制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是NA2S2O3、AGNO3。

2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性测定的最佳试验条件
以邻苯二酚为底物时,底物浓度宜大于20mmol/L,其最适波长为420nm,最适pH值为6.8,
最适温度为50℃,反应时间不宜超过20min,反应完成后在20min后测定PPO的活性最为稳定。

抑制剂NAHSO4的有效抑制浓度为0.8mmol/L。

2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化
园二色谱分析表明莲藕PPO主要含有α一螺旋和β一折叠结构。

与抑制剂作用后，莲藕PPO活性显著降低，同时伴随其二级结构中α-螺旋结构明显减少，表明莲藕PPO的活性中心可能位于α-螺旋结构中。

荧光分析表明，莲藕PPO与邻苯三酚(pyroGAllic Acid，PA)作用后，酪氨酸残基荧光强度略有降低，入mAx位移不明显，色氨酸残基荧光强度略有降低，入mAx红移2 nm；而与莲藕多酚(LoTus rooT polypHenol，LRP)作用后，莲藕PPO分子中酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)残基荧光强度显著提高，且其最大发射波长分别蓝移6nm和红移5nm。

当加入异Vc钠后，Tyr和Trp残基最大发射峰显著红移，说明Trp和防残基位于一定的疏水环境对维持PPO催化活性的优势构象至关重要。

2.7 磁场和抑制剂对莲藕多酚氧化酶反应动力学的影响
以邻苯二酚为底物,莲藕PPO褐变反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学,Km为0.775mol/L,VmAx为11.150U/min。

Vc对PPO有较强的抑制作用,反应动力学参数Km为0.081mol/L,VmAx为3.243U/min,呈现反竞争性抑制,表现为褐变出现滞后,随Vc浓度的增大滞后时间逐渐增长,且呈现S型趋势,并建立了相应的反应方程。

不同磁场强度下,随着处理时间的变化,PPO活性呈现波动性。

3.17A/m磁场强度下处理4H的酶液其反应动力学曲线表现为S型,并建立了相应的反应方程。

2.8 南湖菱果中多酚氧化酶抑制剂对其活性的影响
南湖菱PPO催化反应的最适温度为30 0C ,最适pH 6.5 ,最佳吸收波长420 nm ,最大反应速度VmAx=33.67 uniT/min，米氏常数K m= 0.286 mol/L。

在3种抑制剂抗坏血酸、EDTA和柠檬酸中，抗坏血酸的抑制效果最好，最佳浓度为0.3 mmol/L。

2.9 二氧化氯(ClO2)对鲜切莲藕在低温贮藏期间多酚氧化酶(PPO)的影响
100mG／L浓度的ClO2处理鲜切藕片5min、10 min、15 min后，在贮藏期间能抑制PPO 的活性，而10 mG／L浓度对PPO的活性不起抑制作用反而促进了PPO的活性．100 mG／L ClO2处理鲜切藕片10 min抑制PPO的活性效果最好。

2.10 底物浓度、pH、温度对鲜切莲藕中PPO酶的影响
鲜切莲藕的PPO活性最适反应底物浓度为0.02 mol/L，并且底物浓度与PPO活性的关系完全遵循MicHeAlis-MenTen的酶促动力学性质。

PPO最适pH值为7.O，pH对PPO的影响显著，当pH<4.0时，PPO活性显著下降，可见，调节pH值可有效地抑制PPO活力。

PPO
活性的最适温度为35℃，在o ℃-5℃之间，莲藕的PPO活性受到明显的抑制。

2.11 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响
添加抑制剂可使莲藕PPO反应速率发生变化。

苯甲酸I可与酶E结合生成无活性的二元复合物EI，减小可供邻苯二酚进攻的游离酶E的浓度，也就降低了酶一底物ES的浓度，而且再增加底物浓度，反应速率都不可能达到无抑制剂时的最大速率y mAx，从而破坏了莲藕PPO的正常催化氧化反应系统。

2.12 护色处理对多酚氧化酶活性的影响
对鲜切莲藕褐变抑制的最佳囚子组合为EDTA浓度为0.25% , Vc浓度为0.1%、草酸浓度为0.25%半胱氨酸浓度为0.7%、处理时间为8min。

2.13 气调包装对鲜切莲藕的保鲜效果
采用8种不同浓度配比的O2、N2和CO2气体对鲜切莲藕进行包装，置于4℃下贮藏，定期测定鲜切莲藕VC的含量、多酚氧化酶活性、褐变度以及pH值变化，结果显示100％O2组处理的鲜切莲藕，其外观最好，多酚氧化酶活性受到抑制。

三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标
3.1 对多酚氧化酶的提取：
匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接用于研究）
将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，4。

C下静置4H，抽滤，所得滤液即为粗酶液。

3.2 PPO活性的测定
取浓度0．05 mol／L，pH值7．0的磷酸盐缓冲溶液1．5 mL于1 cm比色皿中，加入0．1 mol／L的邻苯二酚溶液1．0 mL，ppo粗酶液0．5 mL．混匀后在420 nm处比色，酶液加入后开始计时，每30 s记录1次OD。

随时间的变化值，以最初直线段的斜率(△OD／t)计算酶活力．一个酶活力单位定义为在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0．001所需的酶量．
PPO相对活性=各处理组吸光度值／同组最佳处理组吸光度值×100％。

3.3 影响PPO活性的因素测定
3.3.1 温度对多酚氧化酶活性的影响
在l cm比色皿中，加入浓度为O．05 mol／L，pH值为7．0的磷酸盐缓冲溶液1．5 mL，0．1 mol／L的邻苯二酚溶液1．0 mL。

在20"-50℃(间隔5℃一个处理)下保温10 min，加入相同温度下保温10 mill的PPO粗酶液0．5 mL。

在30 S和l trim。

测定03420值。

3.3.2 pH对多酚氧化酶活性的影响
分别配制pH 6.0,6.5,7.0,7.5,8.0的磷酸缓冲液，在1.2ml 0.2 mol/L的底物中分别加入上述缓冲液1.6ml,30 0C水浴，再加入0.2 ml酶液，于420 nm处测OD值，计算酶活力。

3.3.3 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响
(1)方法1: 抑制剂为抗坏血酸、EDTA和柠檬酸在1.6 ml 25 mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.5),1.2ml 0.2mol/L邻苯二酚溶液和0.2 ml酶液混合液中加入0.1 ml不同浓度的抑制剂，以0.1 ml蒸馏水代替抑制剂作为对照.按1.2.3节方法测PPO活性。

预期结果：抑制剂抗坏血酸、EDTA和柠檬酸对南湖菱PPO的活性均有一定的抑制能力，且随抑制剂浓度的增大，对PPO活性的抑制作用增强，其中，抗坏血酸的抑制效果最好。

（2）方法2：抑制剂为抗坏血酸、亚硫酸钠用浓度为0 05 mol／L，pH值为7．0的磷酸盐缓冲配制不同浓度的抑制剂溶液．在1 m的比色皿中，分别加入上述抑制溶液1．5ml，0．1 mol／L的邻苯二酚溶液1．0mol，PPO粗酶液0．5ml，在室温条件F测定PPO的活性。

预期结果：抗坏血酸和亚硫酸钠对PPO的活性有强烈抑制作用，抗坏血酸对PPO活性的抑制作用是将酶促反应的中间产物醌还原而抑制褐变；亚硫酸钠对PPO活性的抑制作用也是将酶促反应的中间产物醌还原，同时还能与中间产物醌形成稳定的无色物而抑制褐变．亚硫酸钠要考虑SO2，在制品中的残留。

（3）方法3：抑制剂为ClO2 4℃冷藏的新鲜莲藕切成薄片，置于不同处理溶液(ClO2处理浓度:0.10 mg/L, 50 mG/L,100 mG/L; ClO2处理时间:5 min,10 min,15 min;处理后样品的贮藏温度: 4℃)中，浸泡不同时间后取出，控干表面水分，以清水处理作对照(CK)处理的藕片分别装入保鲜袋中置4℃下挽口贮藏10d。

每隔ld测定相关指标。

对照组和处理组均设3个平行。

预期结果：100mG/L ClO2处理l0min的鲜切莲藕褐变度最小。

（4）方法4：抑制剂为Vc 取6支试管，每支试管加入0.5 ml粗酶液、2 ml邻苯二酚溶液和2 ml磷酸盐缓冲液，并分别加入0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 ml质量浓度为0.026 G/L的Vc 溶液，室温下反应S min，在波长420 nm下每隔1 min测定一次吸光度。

预期结果：如图，不同质量浓度的Vc对莲藕多酚氧化酶活性有抑制作用，表现为褐变推迟出现，即存在反应滞后期。

随着Vc质量浓度的增加，滞后时间逐渐延长。

（5）方法5：抑制剂为鲜切莲藕保鲜剂组配正交试验
新鲜莲藕切片，按上表对莲藕进行处理，沥干后用0．04rnm厚LDPE袋真空包装，置于4"C 下贮藏。

用清水处理作对照。

处理后的莲藕片每隔l周测定相关指标，重复3次。

预期结果：PP0活性在鲜切莲藕贮藏期间是呈增加的趋势，经保鲜液处理的样品在贮藏末期仍然能保持在较高水平，保鲜剂的最佳组合为第9组A383C2D1，即0.3％L-Cys+0.5％Ca+0.％Vc十0.5％NaCl。

（6）方法6：抑制剂为NAHSO3和硫脲对石榴PPO活性的影响配制0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8 mol/ L的NAHS03和硫脲溶液，加入反应体系（包括石榴PPO提取液2ml,0.1mol/L的儿茶
酚1ml、不同pH的缓冲液2ml），以加入20%TGA 2ml反应液为对照，测定吸光度值，作出吸光度--抑制剂浓度曲线，以确定适宜的抑制剂浓度。

预期结果：反应液中抑制剂NAHSO3浓度达0.2mmol/ L时酶活下降了63.4%;浓度为0. 4 mmol/ L可100%抑制酶活。

而硫脲对石榴PPO活性的抑制作用不明显，当浓度达到0. 8mmo1/ L时，抑制率仅为9. 76%。

（7）方法7：抑制剂为气调包装取出预冷后的莲藕，洗净去皮，切分为0．5cm左右的薄片，立即进行气调包装。

包装气体按不同的初始气体比例分为第一组5％O2+15％CO：+80％N2，第二组15％O2+5％CO2+80％N2，第三组10％O2+10％CO2+80％N2，第四组20％O2+60％CO2+20％N2，第五组100％O2，第六组100％CO2，第七组100％N2。

为了进行分析比较，第八组采用空气包装作为对照组。

每组包装七个样品，每个样品重约200G。

包装后立刻转移至4℃、相对湿度为85％左右的恒温培养箱中贮藏。

预期结果：鲜切莲藕多酚氧化酶活性随贮藏时间的延长呈现不同的变化趋势。

第四、六、七及对照组的多酚氧化酶活性在第6～8d达到最高后呈现下降趋势，而第一、二、三、五组的多酚氧化酶活性呈现缓慢上升趋势。

（8）方法8：分别配制0.15 G／ml的异Vc钠溶液，0.2 G／L的CACl2，0.15 G／L的半胱氨酸溶液，0.15 G／L的柠檬酸溶液，0.15 G／L EDTA溶液及0.3 mG／ml的莲藕PPO 溶液，混合后测定酶活性。

预期结果：异Vc钠对莲藕PPO有较强的抑制作用，抑制率为96．2％，其次为半胱氨酸、氯化钙、柠檬酸，EDTA的抑制效果最低。

（9）方法9：将已经切片的莲藕放入2%NACl+0.2%NA2S03溶液，护色l0min，然后取出清洗干表面水分；选择EDTA（A）、Vc（B）草酸(C)、半胱氨酸(D)和处理时间(E)为参试囚子，采用L16(45}正交试验方案，如图：
预期结果：如下图，随着贮藏时间的延长，鲜切莲藕多酚氧化酶活性在贮藏期的前期
呈上升趋势，并在第9天达到峰值，其后活性又逐渐下降。

四、论文详细工作进度和安排
2010.11.22 学生选题
2010.11.26 布置论文任务
2010.11.28－2011.3.15 熟悉实验室环境和基本实验操作，准备论文实验所需基本材料2010.12.15 完成并提交文献综述、开题报告和外文翻译
2011.3.15前在学校指定时间完成开题答辩
2011.3.15－2011.5.12 实验
2011.5.17 完成并提交毕业论文
2011.5.31 在学校指定时间进行毕业论文答辩
2011.6.5 完成并提交答辩后的修改论文
五、主要参考文献
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