第五讲 酶的分子修饰
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选择吸附 静电相互作用 位阻因素 催化因素
①选择吸附
化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点选择性地 吸附在低极性区或高极性区，有时可以根据对速 度的饱和效应，检测出蛋白质-修饰剂复合物的形 成。
正像酶-底物复合物那样，蛋白质修饰剂复合物形 成后，修饰过程的速度就加强了，这种速度的加 强，部分是由于选择性吸附的结果。
（3）对酶反应条件的选择：
①反应体系中酶与修饰剂的分子比例 ②反应体系中的溶剂性质、盐浓度和pH条件 ③反应温度及时间
5.2、酶分子的修饰方法
物理修饰：
不改变酶的组成单位及其基团的修饰，即酶分子中的 共价键不发生改变，只是在物理因素（高温、高压、 高盐、极端pH值）作用下，副键发生某些变化和重排。
讨论:自然界中存在酶分子改造修饰吗？
酶原激活
胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原
可逆共价调节
磷酸化酶a与磷酸化酶b互变
2、酶分子修饰的意义
增强酶的稳定性（stability） 提高酶的活力（activity） 降低或消除酶的抗原性（immunological property） 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子
★旋转自由度
加快修饰反应速度的一个重要原因是限制了构象 的总数(即限制了旋转自由度)，这种限制可能是 由于上述提及的几类相互作用引起的。
酚酸的酯化速度：在苯环上引入几个甲基，特
别是在同一碳原子上引入2个甲基，则限制了基团 的自由旋转，因而使酚酸的酯化速度常数提高了 108倍以上。
2、影响修饰剂反应性的因素
电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度
①微区的极性
微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。 极性对整个反应速度影响与反应的类型有密切关系。
从整体看来，局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸 和胱氨酸反应性的影响较小
对氨基和组氨酸反应性的影响较大 对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性影响最大
蛋白质分子的表面特点也影响化学试剂的接近 因此，有必要考察局部衡区对功能基和修饰剂的影响。
由于功能基的反应性是通过它的亲核性来测量Baidu Nhomakorabea，应 当强调pKa和影响pKa的因素。
2、修饰剂的反应性
1、影响酶蛋白功能基团的反应性因素
①微区的极性 ②基团间的氢键 ③静电效应 ④位阻效应 ⑤其它
化学修饰：
★广义:指凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的
转变。
★狭义:指在较温和的条件下以可控的方式使一种蛋白质 与某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残 基或其功能基团发生共价的化学变化。
一、影响酶分子化学修饰的主要因素
1、酶蛋白功能基团的反应性
蛋白质功能基团所处的环境会强烈地影响它的物理和 化学性质
②静电相互作用
带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相 反电荷的部位，静电相互作用可使修饰剂向多功能 部位中的一个残基定位或向双功能基的一侧定位。 修饰剂的静电取向也是影响其反应性的一个因素。
子改造，以获得化学结构更合理的酶蛋白； ★对天然酶分子进行改造：包括酶一级结构中氨基
酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等。
5.1、酶分子修饰的定义及其意义
1、定义：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变， 从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质）， 特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构 和性质。
②基团间的氢键作用
在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的pKa应比正 常值低，而酚基的pKa高于正常值。
OH
OH
COOH
C O1/2- +H+ O 1/2-
③静电效应
用高分辨率的核磁共振组氨酸残基的电离行为 进行研究表明，不同蛋白质中的组氨酸残基的 pKa是不同的；
原因可能在于带电基团相互静电作用的影响。
酶的应用受到了很大限制促使科研工作者必须不断地开展新的 研究，用化学或分子生物学方法对酶分子进行改造，以满足各 种反应条件对酶的需求，克服天然酶的缺陷。
随着各个学科及相关技术的发展，特别对酶结构 与功能的深入了解、基因工程及固定化技术的普 及，酶的分子改造工程进入实用阶段。
总体来说酶的分子工程分两部分： ★分子生物学水平：即用基因工程方法对DNA进行分
第五讲 酶分子修饰
讲课：阳 飞 系部：生化系
作业
第五讲 酶分子修饰
教学目标：
了解有关酶分子修饰的重要应用以及酶分子的物理修饰作用 理解蛋白酶化学修饰的方法和意义 掌握酶分子化学修饰的形式、目的、原理与特点
教学重点：
酶分子化学修饰的方法和意义、酶分子化学修饰的形式
教学难点：
④位阻效应
烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能 基接触，出现位阻效应。
对枯草杆菌蛋白酶BPN的X射线衍射研究指出：10个 酪氨酸残基均在蛋白质分子表面，而且苯酚的羟基 几乎在所有情况下都没有形成氢键。对它进行彻底 硝化和碘化后，10个酪氨酸中只有8个被修饰。若 没有X射线衍射研究结果，很可能解释为至少有2个 酪氨酸残基被包埋在分子内部，但实际情况并不是 这样的，这种情况很可能是空间障碍引起的。
化学修饰的原理与特点
第五讲 酶分子修饰
5.1、酶分子修饰的定义及其意义 5.2、酶分子修饰方法 5.3、酶修饰后的性质变化 5.4、酶的分子定向进化
分析酶在工业生产中应用受到极大限制的原因？
热稳定性差 活力低 耐受pH范围窄 分子量过大 成本高 来源有限 有异体反应
和各种物理因素对酶分子空间构象（structure）的影响
3、酶分子修饰的基本要求和条件
（1）对酶性质的了解：
①酶的稳定性：热稳定性、酸碱稳定性、抑制剂等 ②酶活性中心的状况：活性中心基团、辅因子以及分子大小、性状、亚基数
（2）对修饰剂的要求：
①良好的生物相容性和水溶性 ②修饰剂的相对分子质量（较大）、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性 ③修饰剂上反应基团的数目及位置 ④修饰剂上反应基团的活化方法与条件
①选择吸附
化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点选择性地 吸附在低极性区或高极性区，有时可以根据对速 度的饱和效应，检测出蛋白质-修饰剂复合物的形 成。
正像酶-底物复合物那样，蛋白质修饰剂复合物形 成后，修饰过程的速度就加强了，这种速度的加 强，部分是由于选择性吸附的结果。
（3）对酶反应条件的选择：
①反应体系中酶与修饰剂的分子比例 ②反应体系中的溶剂性质、盐浓度和pH条件 ③反应温度及时间
5.2、酶分子的修饰方法
物理修饰：
不改变酶的组成单位及其基团的修饰，即酶分子中的 共价键不发生改变，只是在物理因素（高温、高压、 高盐、极端pH值）作用下，副键发生某些变化和重排。
讨论:自然界中存在酶分子改造修饰吗？
酶原激活
胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原
可逆共价调节
磷酸化酶a与磷酸化酶b互变
2、酶分子修饰的意义
增强酶的稳定性（stability） 提高酶的活力（activity） 降低或消除酶的抗原性（immunological property） 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子
★旋转自由度
加快修饰反应速度的一个重要原因是限制了构象 的总数(即限制了旋转自由度)，这种限制可能是 由于上述提及的几类相互作用引起的。
酚酸的酯化速度：在苯环上引入几个甲基，特
别是在同一碳原子上引入2个甲基，则限制了基团 的自由旋转，因而使酚酸的酯化速度常数提高了 108倍以上。
2、影响修饰剂反应性的因素
电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度
①微区的极性
微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。 极性对整个反应速度影响与反应的类型有密切关系。
从整体看来，局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸 和胱氨酸反应性的影响较小
对氨基和组氨酸反应性的影响较大 对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性影响最大
蛋白质分子的表面特点也影响化学试剂的接近 因此，有必要考察局部衡区对功能基和修饰剂的影响。
由于功能基的反应性是通过它的亲核性来测量Baidu Nhomakorabea，应 当强调pKa和影响pKa的因素。
2、修饰剂的反应性
1、影响酶蛋白功能基团的反应性因素
①微区的极性 ②基团间的氢键 ③静电效应 ④位阻效应 ⑤其它
化学修饰：
★广义:指凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的
转变。
★狭义:指在较温和的条件下以可控的方式使一种蛋白质 与某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残 基或其功能基团发生共价的化学变化。
一、影响酶分子化学修饰的主要因素
1、酶蛋白功能基团的反应性
蛋白质功能基团所处的环境会强烈地影响它的物理和 化学性质
②静电相互作用
带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相 反电荷的部位，静电相互作用可使修饰剂向多功能 部位中的一个残基定位或向双功能基的一侧定位。 修饰剂的静电取向也是影响其反应性的一个因素。
子改造，以获得化学结构更合理的酶蛋白； ★对天然酶分子进行改造：包括酶一级结构中氨基
酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等。
5.1、酶分子修饰的定义及其意义
1、定义：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变， 从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质）， 特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构 和性质。
②基团间的氢键作用
在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的pKa应比正 常值低，而酚基的pKa高于正常值。
OH
OH
COOH
C O1/2- +H+ O 1/2-
③静电效应
用高分辨率的核磁共振组氨酸残基的电离行为 进行研究表明，不同蛋白质中的组氨酸残基的 pKa是不同的；
原因可能在于带电基团相互静电作用的影响。
酶的应用受到了很大限制促使科研工作者必须不断地开展新的 研究，用化学或分子生物学方法对酶分子进行改造，以满足各 种反应条件对酶的需求，克服天然酶的缺陷。
随着各个学科及相关技术的发展，特别对酶结构 与功能的深入了解、基因工程及固定化技术的普 及，酶的分子改造工程进入实用阶段。
总体来说酶的分子工程分两部分： ★分子生物学水平：即用基因工程方法对DNA进行分
第五讲 酶分子修饰
讲课：阳 飞 系部：生化系
作业
第五讲 酶分子修饰
教学目标：
了解有关酶分子修饰的重要应用以及酶分子的物理修饰作用 理解蛋白酶化学修饰的方法和意义 掌握酶分子化学修饰的形式、目的、原理与特点
教学重点：
酶分子化学修饰的方法和意义、酶分子化学修饰的形式
教学难点：
④位阻效应
烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能 基接触，出现位阻效应。
对枯草杆菌蛋白酶BPN的X射线衍射研究指出：10个 酪氨酸残基均在蛋白质分子表面，而且苯酚的羟基 几乎在所有情况下都没有形成氢键。对它进行彻底 硝化和碘化后，10个酪氨酸中只有8个被修饰。若 没有X射线衍射研究结果，很可能解释为至少有2个 酪氨酸残基被包埋在分子内部，但实际情况并不是 这样的，这种情况很可能是空间障碍引起的。
化学修饰的原理与特点
第五讲 酶分子修饰
5.1、酶分子修饰的定义及其意义 5.2、酶分子修饰方法 5.3、酶修饰后的性质变化 5.4、酶的分子定向进化
分析酶在工业生产中应用受到极大限制的原因？
热稳定性差 活力低 耐受pH范围窄 分子量过大 成本高 来源有限 有异体反应
和各种物理因素对酶分子空间构象（structure）的影响
3、酶分子修饰的基本要求和条件
（1）对酶性质的了解：
①酶的稳定性：热稳定性、酸碱稳定性、抑制剂等 ②酶活性中心的状况：活性中心基团、辅因子以及分子大小、性状、亚基数
（2）对修饰剂的要求：
①良好的生物相容性和水溶性 ②修饰剂的相对分子质量（较大）、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性 ③修饰剂上反应基团的数目及位置 ④修饰剂上反应基团的活化方法与条件