第三章基因工程制药4节

平后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加质粒
拷贝数。 但是，在外源基因大量表达的同时，质粒上其他基 因的表达水平也相应增加不利于基因产物的分离 纯化。

某些蛋白质在真核系统中是可溶性的，但 在大肠杆菌中表达后却成为不溶性蛋白质。 这很可能是由于外源蛋白质在大肠杆菌中 大量表达时，它们的构象发生了改变，或 由于存在不合适的二硫键，或由于不能自 由折叠，因而不能形成具有生物活性的蛋 白质，而形成不溶性的包含体，这种包含 体的形成大大降低了表达产物对宿主的毒 害作用。
pBV220系统优点：
① cIts857抑制子基因与PL启动子同在一个载 体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性 较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。 ② SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始
ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；
③ 强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，
有利于质粒-宿主系统的稳定；
（7）产物的产量、产率高，产物容易 提取纯化。
一、宿主细胞的选择（3）
宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆 菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、
丝状真菌、哺乳动物细胞等。
⒈ 原核细胞
⑴大肠杆菌
因为大肠杆菌的分子遗传学 研究深入，生长迅速，所以目前 仍是基因工程研究中采用最多的 原核表达体系。
体，表达产物需经变性复性才恢复其生物活性。
♦蛋白质产物不能糖基化。只适于表达不经塘基化等
翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白
♦产物蛋白质N端多余一个甲硫氨酸残基，容易引起
免疫反应。
♦其内毒素很难除去。 ♦产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。
⑵ 枯草芽胞杆菌
分泌能力强，蛋白质不形 成包含体。产物蛋白质不能糖 基化。有很强的胞外蛋白酶对 产物降解。从而使其应用受到 影响。
量可达细胞总蛋白的20%～30%；
♥ 产物以包含体形式存在于细胞内，表达产
物不易降解，均一性好。
pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯 化的融合表达载体。 该质粒在PR、PL启动子下游插入proteinG的 IgG Fc结合区基因片段180个碱基对，下游是 多克隆位点，引入剪切融合蛋白的切点，具有与 IgG结合的活性，可进行亲和层析，简化了下游 处理工艺。质粒中有目的基因融合位点及蛋白剪 切位点，使目的基因产物纯化后能恢复到天然状 态。
究的首选体系。
原核细胞的基因组特点：
①染色质为环状双股DNA分子 ②具有操纵子结构 ③结构基因多为单拷贝 ④特定区域分布特异DNA顺序
因此外源DNA分子可以插入原核细胞
DNA复制体系的特定区段
1、载体 基因工程的目的和基本手段：是选用合 适的载体把供体DNA（外源基因）运
载到受体细胞内，从而复制扩增大量

④密码子组成

真核系统中“喜欢用”的密码子，在原核
细胞中的翻译效率有可能下降。为了提高
表达水平，在根据蛋白质结构来设计引物
或合成基因时，应选择使用大肠杆菌“偏
爱”的密码子。
⑶ 表达产物的稳定性
为提高表达产物在菌体内的稳定性（蛋白酶），可
以采用下列四种方法：
①组建融合基因，产生融合蛋白。许多融合蛋白与
的目的DNA分子或转录表达为相应的
产物。
基因工程载体分为： 克隆载体 转录载体 表达载体
克隆载体 转录载体 DNA DNA RNA 表 达 载 体
蛋白质
基因工程制药克隆载体的特点：
①具有复制子，能独立地复制 ②有单一限制内切酶酶切位点或多克
隆位点
③有选择性遗传标记如抗药基因
④拷贝数高
⑤生物安全性好
目前使用最广泛的宿主菌
是大肠杆菌和酿酒酵母,已建立
了许多适合它们的克隆载体和 DNA导入方法。许多外源基因
已获得成功表达。
二、大肠杆菌中的基因表达

大肠杆菌做为外源基因的表达宿主，遗传
背景清楚，技术操作简便，培养条件简单，
大规模发酵经济，因此倍受遗传工程专家
的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛、最
成功的表达体系，并常常作为高效表达研


⑷ 细胞代谢负荷
⑸ 工程菌的培养条件
⑴ 外源基因的拷贝数
将外源基因克隆到高拷贝数的表达质粒上，
含外源基因的重组表达质粒拷贝数的增加，
必然导致外源基因拷贝数的提高。
⑵ 外源基因的表达效率
①启动子的强弱
②核糖体接合位点的有效性 ③SD序列和起始密码ATG的间距 ④密码子组成 都会不同程度地影响外源基因的表达效率
来源。
大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足、扩大了药物筛选
上周内容回顾（2）

制备基因工程药物的一般程序？
组建重组质粒 产物分离纯化 包装 构件基因工程菌或细胞 除菌过滤 半成品检定 培养工 成品检 程菌 定
获得目的基因

生物制药所用菌种的获得途径有哪些？
诱变育种、基因工程构建、细胞工程、自然界分离
融合表达质粒pBG-2的结构
⒉ 影响目的基因 在大肠杆菌中表达的因素

外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产 量呈正相关。细胞浓度与生长速率、外源基 因拷贝数和表达产物产量之间存在着一个动 态平衡，只有保持最佳的动态平衡才能获得 最高产量。
细胞产量
取决于：

⑴ 外源基因的拷贝数 ⑵ 外源基因的表达效率 ⑶ 表达产物的稳定性
①大小 小型质粒1.5～15kb , 大型质粒 60～120kb ②复制类型: 严紧型质粒, 松弛型质粒 ③拷贝数
④电泳特点
⑤不相容性
质粒 （Plasmid）
是存在于细 菌染色体外的小 型环状双链DNA 分子,大小约为 数千碱基对。常 有1 ~ 3个抗药 性基因，以利于 筛选。
质粒的分类:
⒈ 按复制型式： ①严紧型 ②松弛型 ⒉ 按基因转移性：①传递性质粒 ②非传递 性质粒 ⒊ 按遗传性状产物分类：

从真核中获得目的基因的基本方法有哪些？
主要方法有：异转录法、RT-PCR法、化学合成法
(编码序列富集法、岛屿获救PCR法、动物杂交法、功能克隆法、构建cDNA文库、差 异显示技术的应用，对已发现基因的改造)
第四节 基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中 的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因高效表达研究是指 外源基因在某种细胞中的表达活动，即 剪切下外源基因片段，拼接到另一个基 因表达体系中，使其能获得原生物活性 又可高产的表达产物。
上次内容回顾（1）

基因工程技术？
胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基 因在工程菌内进行复制和表达的技术。
基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细

第一个基因工程产品？
1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。

基因工程的方法生产医药的优点体现在哪些方面？
减弱表达产物的降解。黄嘌呤核苷(Ion)是大肠
杆菌合成蛋白酶的主要底物， Ion-营养缺陷型大
肠杆菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白
酶，减少了表达产物在细胞体内的降解。
⑷ 细胞代谢负荷
必须进行合理的调节，使宿主细胞的代谢负荷不至
过重，又能使外源基因高效表达。
分成两个阶段培养，当细胞的生物量积累到一定水
酶所识别。
表达载体必须具备的条件（2）

（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有 当阻遏时才能进行转录。外源基因的高效表达往 往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使 宿主细胞免除此不良影响。先使宿主细胞较快地 增殖积累到相当量，再通过瞬时消除此阻遏使所 表达蛋白质在短时间内大量积累，从而减弱表达
产物的降解。同时启动子受调节因素调节后，表
达质粒的拷贝数将大大提高，外源基因量的增大，
对提高外源基因总体表达水平非常有利。
表达载体必须具备的条件（3）
（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集
中力量转录克隆的外源基因，而不转录其它无关
基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳 定。 （6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号， 即起始密码AUG和SD序列（Shine –Dalgarno sequence）,以便转录后能顺利翻译。
①抗生素抗性
②限制酶修饰酶系统
真核基因在大肠杆菌中复制与表达必 须有合适的表达载体把它导入宿主
菌中，然后将其表达成蛋白质。
基因工程制药所用的表达载体 必须具备的条件（1）
（1）载体能够独立地复制。载体本身是一个复制子， 具有复制起点。 （2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利 于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且克隆位点应 位于启动子序列后，以便克隆的外源基因得以表达。 （ 3）具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合
天然的真核蛋白相比较，在细菌体内比较稳定，
不易被细菌酶类所降解。 ②利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的 信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙 中，而使外源蛋白不易被酶降解。
③采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫 键的位置，从而增加蛋白质的稳定性。
④选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，有可能
目前使用的载体按特性可分为：
①质粒
②λ噬菌体 ③黏性质粒
④M13噬菌体
⑤酵母 ⑥真核细胞、病毒载体
细菌质粒的生物学特性
质粒（Plasmid）的定义： 质粒是存在于细菌等微生物细胞染色质
以外的共价闭环的双股DNA分子，具有
独立自主复制和调控能力，可赋予宿主 细胞一定的生物性状。
质粒的生物学特性
②核糖体结合位点的有效性

大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的 高效表达十分重要。所以必须增加核糖体结合点 的有效性，消除在核糖体结合位点及其附近的潜 在二级结构。 表达非融合蛋白的关键是原核SD序列和真核起始 密码ATG之间的距离，距离过长或过短都会影响 真核基因的表达。
③SD序列和起始密码ATG的间距
常用表达载体 ⑴ pBV220系统 质粒pBV220的结构
pBV220系统国内使用最多的载体,其组成:
①来源于pUC8多克隆位点
②核糖体rrnB基因终止信号
③pBR322第4225～3735位
④pUC18第2066～680位
⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子
⑥pRC23的PL启动子及SD序列共3665bp
④ 整个质粒仅为3.66kb，有利于 增加其拷贝数及容量，可以插入 大片段外源基因； ⑤ PR和PL启动子串联，可以增强启
动作用。
♥ pBV220系统宿主菌可以是大肠杆菌
HB101、JM103、C600，质粒拷贝数
较多，因此小量百度文库便快速提取即可满足研
究及生产过程中检测和鉴定的需要。
♥ pBV220系统为温度诱导，外源基因表达
⑵ 丝状真菌
优点：分泌能力强，能正确进
行翻译后加工（肽剪切、糖基化）， 糖基化方式与高等真核生物相似。有
成熟的发酵和后处理工艺。
⑶ 哺乳动物细胞 优点：表达产物可由重组转化细 胞分泌到培养液中，纯化容易。产物 是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培养 条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。
大肠杆菌用于基因表达的特点
♦表达基因产物形式多样:细胞内不溶 性表达(包含体)、细胞内可溶性表 达、细胞周质表达等。极少数情况 下还可分泌到细胞外表达。
♦大肠杆菌中的表达不存在信号肽， 产品多为胞内产物，提取时需要 破碎细胞，故细胞质内其它蛋白 质也释放出来，造成提取困难。
♦因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含
⑶ 链霉菌
作为外源性基因表达受到重视。特 点：不致病、使用安全、分泌能力强、 表达产物直接分泌到培养基中、表达产
物可糖基化。
⒉ 真核细胞
⑴ 酵母 酵母菌是研究基因表达最 有效的单细胞真核微生物。其基因 组小，世代时间短，有单倍体双倍 体两种形式，繁殖迅速，无毒性。 能胞外分泌表达产物，产物可糖基 化。已有不少真核基因成功表达。 如干扰素、乙肝表面抗原基因等。
①启动子的强弱

需强的启动子。由于真核基因启动子不能被大肠 杆菌RNA聚合酶识别，因此在进行真核基因高效
表达时，必须将真核基因编码区置于大肠杆菌
RNA聚合酶能识别的强启动子控制下，选择具有
强启动子的表达裁体。常用的强启动子有lac、
trp、tac、λPL、bla等。将目的基因插入表达载
体启动子的下游，可以增加基因的表达。
最佳的基因表达体系：目的 基因的表达产量高、表达产物稳 定、生物活性高和表达产物容易 分离纯化。（四点）
一、宿主细胞的选择（1）
适合目的基因表达的宿主细胞应 满足以下要求: （1）容易获得较高浓度的细胞；
（2）能利用易得廉价原料；
（3）不致病、不产生内毒素；
一、宿主细胞的选择（2）
（4）发热量低、需氧低、适当的发酵 温度和细胞形态； （5）容易进行代谢调控； （6）容易进行DNA重组技术操作；