基因结构分析的基本策略

Crayfish: GGKDSCQGDSGGPLAASDTGSTYLAGIVSWGYGCARPGYPGVYTEVSYHVDWIKANAV--
保守序列
2019年6月18
插入？ •当两个序列非常相似时，是否一定
感说谢你明的观它看 们具有相似的功能？
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•NCBI数据库
NCBI首先创建GenBank数据库
•可 以 通 过 下 拉 菜 单 选 择 记 录 的 显 示 格 式 ， 通 常 选 择 GenBank Report格式或FASTA Report格式。
•当选择GenBank Report格式后，屏幕显示较完整的基因记录，包 括 ： 基 因 位 点 (Locus ） 、 基 因 定 义 (Definition ） 、 基 因 存 取 号 (Accession）、 核酸编号(NID ）、关键词(Keywords）、 来源 (Source）、组织分类(Organism)、参考文献(Reference)、 著者 (Author ） 、 题 目 (Title ） 、 期 刊 (Journal ） 、 Medline 存 取 号 (Medline）、序列特征(Features）、基因(Gene）、CDS（cDNA）、 等位基因(Allele） 对等的肽(Mat-Peptide ）、计算碱基数(Base Count）、原序列(Origin）。
(5) PopSet
•包含研究一个人群、一个种系发生或描述人群 变化的一组组联合序列 •PopSet既包含了核酸序列数据又包含了蛋白质 序列数据
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(7) 文献数据库
•PubMed：生物医药科学的检索系统 •OMIM：孟德尔遗传学数据库是人类基因和基 因疾病的目录数据库
•于 1991 年 开 发 了 Entrez 数 据 库 检 索 系 统 ， 该 系 统 整 合 了 GenBank、EMBL、PIR和SWISS-PROT等数据库的序列信息 以及MEDLINE有关序列的文献信息，并通过相关链接，将他 们有机地结合在一起
•NCBI 还 提 供 了 其 他 数 据 库 ， 包 括 在 线 人 类 孟 德 尔 遗 传 (OMIM）、三维蛋白结构的分子模型数据库（MMDB）、人 类 基 因 序 列 集 成 （ UniGene ） 、 人 类 基 因 组 基 因 图 谱 （GMHG）、生物门类（Toxonomy） 等数据库
•该数据库包括原文信息、图片和参考信息， 同 时 还 可 以 链 接 到 Entrez 系 统 MEDLINE 数 据库中相关文献和序列信息
•其他：书目，杂志，文章引用匹配等
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2. NCBI数据库检索
•在检索框中输入检索词，检索词间默认逻辑关 系为AND，检索规则基本同PubMed
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-3 +1 +5 ATG Initiator 感谢你的观看 Py2CAPy5
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二、基因转录起始点的序列分析
思考： •转录起始点 (TSS)位于基因编码序列的5端 •基因编码区是指能体现在多肽链中的核苷酸 序列 •多肽链是以mRNA为模板经翻译合成的
2. 多序列比对
否具有足够的相似性 从而判断二者之间是否具
有同源性
2019年6月18 进化上曾具有共同祖先感谢你的观看
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序列比对的结果：
•取代 •插入 •缺失
保守序列： •可能是共同进化的标志 缺失？ •可能并不代表功能的重要性
Mouse: GGKDSCQGDSGGPVVCNG----QLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAAN
AAAAAn TTTTT15-18
反转录酶的末端转移酶活性 Oligo (dG)15-18
TTTTT15-18
与线性载体相连接 要求：
克隆扩增，感5谢端你测的观序看分析
cDNA的5端完整无缺
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2. cDNA末端快速扩增技术(RACE)
•传统的RACE：
3-
nGGGGG
nGGGGG
nCCCCC
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第二节 基因转录起始点的鉴定
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主要内容： 一、基因转录起始点的序列特征 二、基因转录起始点的序列分析
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一、基因转录起始点的序列特征
1. 真核基因及其调控元件
顺式作用元件
-GCGC---CAAT---TATA
•在识别位点下游18~20碱基处切开双链DNA
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Gppp
p
XhoI MmeI
•主要有两种方法：
•5 ′端连续分析基因表达（5 ′ -end serial analysis of gene expression, 5 ′ SAGE）
•帽分析基因表达（cap analysis gene expression, CAGE）
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(1) 5 ′ SAGE
反转录酶 10nt 随机引物
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5-RACE adaptor 5-RACE adaptor 5-RACE adaptor
5-RACE adaptor
长短不同的cDNA
随机引物
用10nt随机引物与5-RACE引物 进行PCR扩增
5-RACE adaptor
5-RACE adaptor 5-RACE adaptor 5-RACE adaptor
因此， 分析鉴定TSS的方法都是以cDNA为切入点
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1. cDNA克隆测序
mRNA
CCCCC
cDNA第一链 cDNA第二链
nGGGG
nCCCC cDNA第一链
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mRNA
AAAAAn AAAAAn AAAAAn
反转录酶 Oligo (dT)15-18
锚定引物 2019年6月18
mRNA cDNA
PCR产物
mRNA
AAAAAn
反转录酶
Oligo (dT)15-18
末端转移酶 dGTP
AAAAAn
TTTTT15-18 -5
TTTTT15-18
锚定PCR扩增
TTTTT15-18
特异引物 感谢你的观看
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•Deep-RACE：
用寡核苷酸替代mRNA的5′端帽结构以及
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点击核酸序列blast，在框内输入序列：
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选择搜索条件：
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选择特殊程序：
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比较两个序列之间的相似性：
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以上仅简介了NCBI相关数据库及工具软 件关于其他数据库及软件工具等信息见书中 第二十五章表1-5。
蛋白质
核苷酸 （翻译）
蛋白质
核苷酸 （翻译）
核苷酸 （翻译）
内容 使用取代矩阵寻找较远的关系： 可以进行SEG过滤 寻找较高分值的匹配，对较远关系 不太适用 对于新的DNA序列和ESTs的分析极 为有用 对于寻找数据库中没有标注的编码 区极为有用 对于分析EST极为有用
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1. 各种数据库的介绍
(1) Nucleotide
•该数据库由国际核苷酸序列数据库成员美国 国立卫生研究院GenBank、日本DNA数据库 (DDBJ)和英国Hinxton Hall的欧洲分子生物学 实验室数据库(EMBL）三部分数据组成
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•向下拉寻找关注的内容
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•可以直接拷贝保存相关内容
•凡是连接的地方都可以点击查看
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3. NCBI数据库搜索工具
•Entrez：
是一个用以整合NCBI数据库中信息的
搜寻和检索工具 •Entrez的一个强大和独特的特点
结构基因
转录起始点
增强子
TATA box
2019年6月18 GC box
CAAT box
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2. 转录起始点（TSS）
II 型启动子的TSS： •没有明确的保守序列 •有一种趋势，即mRNA 的第一个碱基是A， 其侧翼碱基倾向于是嘧啶 •与mRNA第一个碱基对应的位置标记为-1区 •-3 ~ +5区域被称作起始子 (initiator)
•NCBI 已 经 将 结 构 数 据 交 叉 链 接 到 书 目 信 息 、 序 列 数 据 库 和 NCBI的Taxonomy中运用NCBI的3D结构浏览器和Cn3D，可 以很容易地从Entrez获得分子的分子结构间相互作用的图像
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(4) Taxonomy
•即生物学门类数据库，可以按生物学门类进行检 索或浏览其核苷酸序列、蛋白质序列、结构等
•BLAST：
是检索相关的序列，结构，和参考
文献的能力

是一个NCBI开发的序列相似搜索程序，还可作
为鉴别基因和遗传特点的手段
•NCBI 提 供 的 附 加 软 件 工 具 有 ： 开 放 阅 读 框 寻 觅 器 （ORF Finder），电子PCR，和序列提交工具， Sequin和BankIt
•三个组织每天交换各自数据库中的新增序列 实现数据共享
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(2) Genome
•即基因组数据库，提供了多种基因组、完全染 色体、重叠序列图谱以及一体化基因物理图谱
(3) Structures
•即结构数据库或称分子模型数据库(MMDB)， 包含来自X线晶体学和三维结构的实验数据
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•Entrez:

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•BLAST:
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•BLAST程序
程序 Blastp Blastn Blastx Tblastn Tblastx
数据库 蛋白质
查询 蛋白质
核苷酸 核苷酸
核苷酸 （翻译）
•而FASTA Report格式仅包括检出序列的简要特征描述。
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例如：人EPO基因序列检索
•输入关键词，选择合适的程序
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•向下拉寻找符合目标的条目
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•点击此条打开连接
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•5′SAGE是在PCR过程中将MmeI酶切位点引物cDNA的5′ 端，通过酶切和连接获得不同短片段重复序列，并对重 复序列进行测序获得大量片段序列信息
•不同序列的短片段代表不同基因的转录起始点 (TSS)
MmeI:
•是一种特殊的II型限制性核酸内切酶
•识别的序列不是回文结构，而是不对称的DNA 序列5′-TCCRAC-3′（R代表G或A）
发光标记巢氏PCR引物实现高通量鉴定转录
起始点
5-p 帽
mRNA
AAAAAn
牛小肠磷酸酶 (CIP)
5-帽
AAAAAn
烟草酸焦磷酸酶 (TAP)
5-
5-RACE adaptor (寡核苷酸)
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AAAAAn
将5-RACE adaptor (寡核苷 酸)加到脱帽RNA分子上
AAAAAn
PCR产物
随机引物
以5’-RACE引物和5’端甩尾的基因 特异性反向引物进行巢氏PCR
5-RACE adaptor
以5’-RACE发光标记引物对PCR混 合物直接进行一次性测序
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分析基感因谢你转的录观起看始点
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3.连续分析基因转录起始点
•在RACE的基础上，通过在转录本5 ′端引入一 个特殊的II型限制性核酸内切酶识别位点，实 现了基因5 ′端短片段串联连接产物一次测序分 析多个基因转录起始点的目的
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ目录
第一节
基因序列结构的生物信息学 检索和比对分析
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•基因或DNA序列比对
•就是在数据库中对基因序列或DNA序列进行
比对分析，以其能够推测出其结构、功能及在
进化上的联系.
直接的数量关系
•比对方法：
序列比对目的：
1. 双重比对
•判断两个或多个序列间是
第二十五章
基因结构分析的基本 策略
Basic strategy for analyzing gene structure
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主要内容： 第一节 基因序列结构的生物信息学检索和比对
分析 第二节 基因转录起始点的鉴定 第三节 启动子的结构及功能分析 第四节 编码序列结构分析