脉冲场凝胶电泳.

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项
【实验原理】
大分子DNA一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10〜2000kb之间的DNA片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳
是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10〜2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】
1. 制备DNA 样品所需材料
1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%
4ESP缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，Img/mL蛋白酶K。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

7 胶模( 由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。

90.5匕g/mL溴化乙锭
2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料
1 紫外递质。

210mg/mL tRNA。

35mol/L NaCl 。

4 苯酚/ 氯仿。

53mol/L NaAc ，pH5.2。

695%乙醇。

3. 设备
1TBE 缓冲液。

2Seakem HGT 琼脂糖。

3Wide Mini-Sub Cell 凝胶电泳设备。

4 变速泵或蠕动泵(Bio-Red Laboratory 。

5IBI FIJI 600 HV 程序性开关设备。

6 缓冲液冷却循环器(Fotodyne ，New Britain ，WI 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory 。

【实验步骤】
1. 脉冲电场凝胶电泳的DNA 样品的制备
为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂
解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcus
aureus 作为例子。

1取100mL对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4C, 5000g离心5min。

2用20mL TEN缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min。

之后用10mL EC缓
冲液使细胞悬浮。

3取1.5mL细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque琼脂糖的EC
缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于 4 C凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50Co
4对于每一个菌株，需要15〜20个凝胶块，将它们放至含有30〜45卩g/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的
RNase 的10mL EC
缓冲液中，于37 °C振摇过夜。

5去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP缓冲液于50C轻度振摇温育48h。

6将凝胶块放在10mL含有174卩g/mL苯甲基磺酰氟(PMSF的TE缓冲液中，室温温育4h(2h 换液一次，以灭活ESP 中的蛋白酶K 。

7用TE清洗琼脂块6h(2h换液一次，置于TE中4C保存。

2. 限制酶消化
提高PFGE的分辨率取决于100〜1000kb片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。

(生物秀实验频道
125卩L10X反应缓冲液，30U限制酶，加双蒸水至250卩L混匀。

2 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。

3. 应用PFGE对样品DNA进行分析
1用0.5 x TBE缓冲液制备一个0.8%SeakemHG■琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。

若用Wide Minisub Cell
进行电泳的话，50mL 该溶液即可。

2 胶凝后，小心移去样品梳。

将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。

（若样品在溶液中，以l:1
的比率与50C 2%Seaplaque琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中。

3把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14C 冷却。

4 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。

打开电源，调节蠕动泵到适当流速（5〜10mL/rain或打幵变速泵至40。

5 通过计算机启动极性转换程序。

大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为 3.5h 或更长。

小于50kb
的限制性片段在0.4s 正向和0.2s 反向的电脉冲（比率为2:1 下得以分离，时间为3〜5h 。

6在0.5卩g/mL溴化乙锭中进行染色并拍照。

4. 分离、纯化大的DNA 片段
1 凝胶染色、分析后，在目的带前（靠近正极处切一个0.25cm
2 左右的槽，注入0.8%Seaplaque 琼脂糖，使之凝固。

2重新打幵极性转换幵关，用紫外递质检测DNA的迁移，当目的带进入Seaplaque 凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至1.5mL EP 管中。

3 加入2口L 的tRNA，30 口L 5mol/L NaCl，370 口L 蒸馏水，在65〜70C 之间，化胶并保
温10min
4苯酚/氯仿500 口L抽提两次。

5 用2.5 倍体积95%乙醇和1/10 体积NaAc(3mol/L , pH5.2 于-70C 10min 沉淀水相。

再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE
缓冲液中。

【注意事项】
1. 换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。

2. PMSF 是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂,即有毒又挥发,操作时应在通风橱中进行。

3. 用蛋白酶K包埋的材料时50C温育时间很长(24〜48h，有些学者提出如此长时间不必要(Mortimer et
al.1990 ，且可能造成高分子质量DNA降解。

在实验中可视情况而定。

4. 琼脂糖凝胶块在TE(pH7.6中4C可存放数年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更长时间。

5. 一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。

6. 由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为14C，需要一些冷却设
备(缓冲液冷却循环器或MiniChiller 。

此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。

PFGE (脉冲场凝胶电泳)标准操作规程(SOP
目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型
背景知识：这个试验是公认的操作繁琐，至少要2天，而且每一步操作对结
果的好坏都有很大影响，因此，一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的主体内容：
一、胶块的制备
1、在Falcon 2054 管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml 细胞悬
浊液(CSB；
2、在1.5ml eppendorf 管上标记好对应样品的名称；
3、在模具上标记好对应样品的名称；
4、用CSB 湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB 中，
用bioMerieux Vitek colorimeter 测其OD 值，并调整至 3.6~4.5 。

如果OD 值大于 4.5 ，加入CSB 稀释；如果OD 值小于 3.6 ，增加菌量提高其浓度。

5、取400^1细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendof 管中，置于37°C水浴中孵
育5分钟。

将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。

6、从水浴箱中取出eppendof管，每管加入20 ^1蛋白酶K(储存液浓度为
20mg/ml 混匀，使其终浓度为0.5mg/ml 。

7、制备好1%Seakem Gold 1%SDS放于56C水浴箱中。

8、在eppendof 管中加入400 ^1的1% Seakem Gold: 1%SDS用枪头轻轻
混匀。

9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15 分钟。

注意事项：
(1 用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。

(2 细胞悬浊液、蛋白酶K 要置于冰上。

(3在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold: 1%SD时要避免气泡的产生。

(4 混合物加入模具时不能产生气泡。

(5 在加1% Seakem Gold: 1%SDS勺过程中1% Seakem Gold: 1%SD要一直放在56C水浴箱中。

二、细胞的裂解
1 、在50ml 的screw-cap tube 上做好标记。

2、配制细胞裂解液(CLB:每5ml细胞裂解液加入25 口1蛋白酶
K(20mg/ml ，使其终浓度为0.1mg/ml ，然后颠倒混匀。

注意:蛋白酶K 要置于冰上，配制好的细胞CLB 也要置于冰上。

3、每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。

4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。

(1 可重复利用的模具:打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap 管中。

(2 一次性模具:撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap 管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。

5、保证胶块在液面下而不在管壁上。

6、将管子放在54C水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。

7、将纯水和TE放在50C水浴摇床中预热。

三、洗胶块
1 、从水浴摇床中拿出screw-cap 管，盖上绿色的screened-cap 。

轻轻倒
CLB 。

在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。

、I • d:
注意：
把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。

随后的操作中也如此。

2、每管中加入15ml 预热的纯水。

3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50 C水浴摇床中，摇
10分钟。

4、倒掉水，用纯水再洗一次。

、
5、倒掉水，加入15ml预热的TE，在50C的水浴摇床中摇15分钟。

6、倒掉TE ，用TE 重复洗三次，每次10－15分钟。

7、倒掉TE，加入10ml TE，放在4C冰箱保存备用。

注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。

四、胶块内DNA 的酶切
1、在1.5ml eppendorf 管上标记好相应的样品及H981 2的名称。

2、按照下面的比例配制缓冲液H 的稀释液，混匀。

试剂口1/胶块口I /10 胶块
纯水180 口I1800 口1
Buffer D20 口I200 口1
总体积200 口I2000 口1
注意：缓冲液要置于冰上。

3、在每个1.5ml eppendorf 管中加入200 ^1缓冲液H的稀释液。

4、小心从TE 中取出胶块放在干净的培养皿上。

5、用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendof 管中。

确保胶块在液面下面。

将剩余的胶块放回原来的TE 中。

6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。

7、将管子放在37C水浴中孵育10-15分钟。

8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。

试剂口1/胶块口l /10 胶块
纯水175 口11750 口1
Buffer D20 口1200 口1
酶(10U/ 口l5 口l50 口1
总体积200 口l2000 口1
(1将酶置于冰上，用后立即放在—20°C保存。

(2 用枪头吸出缓冲液H ，避免损伤胶块。

9、每管加入200^1混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。

10、在37C水浴中孵育至少2小时。

五、加样
( 一将胶块直接粘在梳子齿上
1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。

用水平仪调整胶槽使
其水平。

2、从37C水浴中取出胶块，平衡到室温
3、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。

4、每管加入200 口I 0.5 X TBE。

5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。

如果用的是10 个齿的梳
子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。

6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约 3 分钟。

7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面
相接触。

从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55C —60C平衡的1% SKG 。

避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。

在室温下凝固30分钟左右。

8、记录加样顺序。

( 二将胶块直接加在加样孔内
1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。

用水平仪调整胶
槽使其水平。

2、把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在55C—60C平
衡的1%SKG 。

避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。

在室温下凝固30分钟左右。

3、小心拔出梳子。

4、从37C水浴中取出胶块，平衡到室温。

5、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。

6、每块胶加入200卩I 0.5 X TBE平衡。

7、用小铲将胶块加入加样孔。

8、用溶化的胶封闭加样孔
a可以在加样孔中加入0.5 X TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。

b 记录加样顺序。

六、电泳
1、确保电泳槽是水平的。

如果不水平，调整槽底部的旋钮。

注意：不要触
碰电极。

2、加入2.2L 0.5 X TBE, 关上盖子。

3、打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约1L/ 分钟和
缓冲液在管道中正常循环。

4、打幵冷凝机，确保预设温度在14C （缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右。

5、打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。

6、设置电泳参数。

7、记录电泳初始电流（通常120－145ma 。

8、结束电泳：关机顺序为：冷凝机－泵－主机。

七、图像的获取
1、取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml,
1: 10,000稀释，即在400ml水中加入40口1储存液。

注意：
EB 是致畸剂。

储存在棕色瓶中的EB 稀释液可以用3-5 次。

废弃的EB 溶液应妥善处理。

2、将托盘放在摇床上摇25-30 分钟。

3、放掉电泳槽中的TBE ，用1-2L 纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。

4、戴上手套将用后的EB 溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加
入400-500ml 纯水，放在摇床上脱色60-90 分钟，如果可能每20-30 分钟换一次纯水。

5、用Gel Doc 2000 拍摄图像。

注意：如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60 分钟。

6、转换成*.1sc 文件用于处理分析。

八、数据的分析
图像的读取
电泳图像通常用BIO-RAD 的GEL DOC 2000或其它成像系统来获取。

其它可以替代的成像设备，只要具有CCD相机，可以提供IBM兼容的未压缩的TIFF图像，且分辨力》768 x 640 像素，能够用BioNumerics software (Applied Maths, Inc. 软件与PulseNet 数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。

运用GEL DOC 2000的简单说明：
QUANTITY ON软件
1、点击QUANTITY ON按钮打幵该软件。

2、点击菜单FILE f GEL DOC
注意：需要10－20 秒打开窗口
3、打幵抽屉，把胶放在台板上。

胶已经经过EB或GEL-STAR染色并经过充
分脱色。

用黑色胶框把胶放在合适的位置。

关上抽屉门。

图像的获取
1、按下EPI-LIGHT 按钮打开白光。

2、把胶放在调准网格线内，使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。

3、保证调准网格线和过饱和按钮被选中。

4、改变镜头的MIDDLE RING以调整图像的大（顺时针小（逆时针，使图像占据整个窗口。

如果需要，挪动胶在台板上的位置。

胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。

5、如果需要，按BOTTOM RIN以调整相机的焦距。

注意：焦距的调整只可以偶尔用之，不可用于每一块胶。

可以用尺子帮助调整焦距。

6、按下EPI-LIGHT 关掉白光，按下UV 按钮打开透射紫外光。

7、点击AUTO EXPOS以确定大概的曝光时间。

当图像出现在窗口时，AUTO EXPOS自动关闭而MANUAL EXPOSE激活。

8、点击MANUAL EXPOS的按钮，调整曝光时间。

而调整饱和度时，点击箭头或TURN THE TOP RINGZ降低光量（如果图像过饱和，图像显现红色。

注意：如果出现对话框“曝光可以在0.03－360秒之间波动”，则需通过改
变相机的像素以调整饱和度。

调整饱和度使样品条带没有红色很重要，因为这会影响BIONUMERIC歎件对胶图像的分析。

而胶加样孔的过饱和属于正常现象。

9、当图像调整的比较满意时，按下FREEZE按钮停止曝光过程。

按下UV按
钮关掉紫外光（如果开门时UV 灯打开，它会自动关闭。

图像的输出
1、保存图像(*.1sc : FILE T SAVE。

确保选择正确的路径。

文件默认的名字包括日期、时间和用户。

可以改变文件名。

2、打印文件：FILE T PRINT T VIDEO PRINT,也可以直接点击屏幕上的PRINT 按钮。

3、转为*.TIFF 格式：FILE T EXPORT TO TIFF IMAGEEXPORT 选择正确的路径。

4、关闭QUANTITY ON程序：FILE T EXIT。

5、取出胶放在染色盒内。

用软麻布擦掉台板表面多余的液体，用水或70％的异丙醇洗干净。

试剂储存液的配制
1、
121.1 g Tris base 溶于650-700 ml 纯水中，加入80 ml 6 N HCl* ，在室温下调pH 至8.0 ，加水终体积至1000 ml ，高压灭菌。

或者157.6 g Tris-HCl 溶于800 ml 纯水中，在室温下调pH 至8.0，加水终体积至1000 ml ，高压灭菌。

2、10 N NaOH*
400 g NaOH小心溶于800 ml纯水中，冷却到室温，加灭菌的纯水使终体积
至1000 ml 。

3、0.5 M EDTA, pH 8.0*
溶于800 ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH至8.0，加水终体
积至1000 ml ，分成数份，高压灭菌。

4、20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS* 十二烷基硫酸钠－用于E. coli
O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, PFGE
将20克SDS小心加入装有80 ml灭菌纯水的容器中，在35° - 45C轻轻混匀溶解，定容至100ml 。

5、20 mg/ml 蛋白酶K 储存液*
100 mg Proteinase K 粉末溶于5 ml 灭菌纯水中，混匀，分装在1.5 ml 离心管中，每管
500-600 口l , -20C保存备用。

6、10X Tris-
0.9 M Tris base (108 g
0.9 M Boric Acid (55 g
0.02 M EDTA, pH 8.0 (40 ml 0.5 M
溶于1000 ml 灭菌的纯水中，高压灭菌
注意：如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。

7、Ethidium Bromide(EB*
10 mg/ml EB的储存液用纯水1:10,000 稀释(即100 ml水中加入10 口I储存液，(500ml 水中加50ul 。

稀释液在丢弃前可以染5-6 块胶。

实验试剂
注意：用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。

1、Tris:EDTA Buffer (TE, pH 8.0* －(10 mM Tris-HCL:1 mM EDTA , pH 8.0
10 ml 1 M Tris-HCL, pH 8.0
2 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
用灭菌的纯水稀释到1000 ml
在 E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, and Campylobacter jejuni PFGE －用TE Buffer 于:
⑴. 溶解1% SeaKem Gold:1% SDS agarose
⑵. 细菌裂解后洗胶块
在L. monocytogenes PFGE －用TE Buffer 于:
⑴. 悬浮菌细胞
⑵. 细菌裂解后洗胶块
2、Cell Suspension Buffer (CS －100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH 8.0
用于 E. coli O157:H7, Salmonella, and Shigella sonnei PFGE
10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.0
20 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
用灭菌的纯水稀释到100 ml
3、Cell Lysis Buffer(CLB －50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH 8.0 + 1%
N-Lauroyl-Sarcosine,
Sodium salt (Sarcosyl ，0.1mg/ml Proteinase K ( 用前再加入
用于裂解 E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei, 和Campylobacter jejuni 25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.0
50 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
50 ml 10% Sarcosyl 3
用灭菌的纯水稀释到500 ml，每5 ml CLB加入25卩I蛋白酶K储存液(20
mg/ml，使其终浓度为0.1 mg/ml.
5、0.5X TBE Buffer
200 ml 5X TBE 用纯水稀释到2000 ml 或
100 ml 10X TBE 用纯水稀释到2000 ml
注意：用来稀释5X TBE、10X TBE 的纯水可以不灭菌。

6、SeaKem Gold Agarose
－做胶块；－电泳胶
报价seakem gold 琼脂糖25g 货号50111，1567元人民币。

可打9 折。

125g 货号50150 ，BMA，6422 元。

7、无菌的超纯水
8、蛋白酶K 粉末或蛋白酶K 溶液(20mg/ml
6、限制性内切酶
E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei
－XbaI, ，AvrII ( 同切限制内切酶BlnI ，SpeI
(NotI 可用于S. sonnei ；但不用于E. coli O157:H7
L. monocytogenes ，－AscI, ApaI
Campylobacter jejuni, C. coli ，－SmaI, KpnI
器材
1、Dade Microscan Turbidity Meter
Spectrophotometer
bioM e rieux Vitek Colorimeter
－调整细胞悬浊液的浓度
2、微波炉－溶胶
3、水浴摇床
—裂解胶块中的细胞(54 C
—用水和TE(50C洗胶块
4、56C水浴箱-平衡和保温熔化的胶
5、25C , 30 C , 37 C水浴箱—酶切
6、50C水浴箱—加热用于洗胶块的水和TE，酶切
7 、离心机。

8、最少需要两个水浴箱—一个平衡到56C，另一个到37C。

如果需要，温度可以上下调动。

Listeria PFGE 中胶块的Apal酶切需30C水浴。

耗材
1、无菌的Falcon 2054(12-mm x 75-mm 或Falcon 2057(17-mm x 100-mm —用于细胞悬浊液的制备
基因公司代理，
2、无菌的聚酯纤维或棉签—用于从琼脂平板上刮取细菌
3、无菌的枪头或巴斯得吸管
4、无菌的1.5 ml 离心管—用于混合细胞悬浊液和胶、酶切
5、无菌的50 ml screw-cap tubes 或50 ml Oak Ridge tubes —用于装胶块，
6、Green Screened Caps(Bio-Rad 1703711 —洗胶块时用伯乐公司货号170-3711 。

7、模具
—10 孔(可重复利用的，2cm x 1cm x 1.5mm
－50 孔（一次性的， 1.5mm x 10mm x 5mm
8、单刃剃须刀、手术刀、平皿或类似物－用于切胶块
9、无菌的一次性皮氏平皿或大的玻璃载物片－用于切胶块
10、一端宽、一端窄的平铲
药铲，生工等公司的实验室耗材部分有。

11、标准胶槽(14 x 13cm 的框和平板
12、10孔的梳子(14 cm 长，1.5 mm宽
13、15 孔的梳子(21 cm 长，1.5 mm 宽一Bio-Rad 170-3627
14、胶水平台
15 、盛放EB 染液的塑料容器
16、70％异丙醇、5%－10%的漂白剂或其它合适的消毒剂
17、各种体积的无菌烧瓶或瓶子(50 ml - 2000 ml
18、各种规格的无菌量筒(100 ml - 2000 ml
19、无菌的吸管(2 ml - 50 ml
20、保护性手套(无石化粉的乳胶手套、聚乙烯手套或腈类手套
21 、防热性手套
22、冰盒
脉冲场凝胶电泳
( PFGE ，Pulsed Field Gel Electrophoresis )是一种分离大分子DNA 的
方法。

在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子(>10kb)移动速度接近，很难分离
形成足以区分的条带。

在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向(有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。

DNA 分子带有负电荷，会朝正极移动。

相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。

因此小分子向前移动的速度比大分子快。

脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb至U 10Mb的DNA分子。

高分子量DNA 琼脂糖凝胶块制备和加工
1 ．收集10ml 全血，加入30ml 细胞裂解液。

置冰浴中至少20min 直至红细胞完全溶解。

2．2000r/min 离心10min ，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS 重悬细胞。

3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer 腔计数细胞。

4. 用PBS重悬细胞，以达到40卩I PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10口g ）
5. 用PBS配制2%浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50C。

6. 将等体积（各1mI ）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。

7. 静置20min 让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/mI 的蛋白酶K 。

8 .将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50C保持2〜3天。

每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的FaIcon 管可容纳多达100个凝胶块。

9. 蛋白酶K 消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA 溶液中保存于4C。

10. 此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE 缓冲液冲洗数遍的步骤。

11. 将凝胶块放入装有TE 及0.04mg/ml PMSF 溶液的Falcon 试管中，灭活残留的蛋白酶K 。

12．室温下用TE 溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L
EDTA, （pH8.0）4C保存凝胶块。

13.若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min X2 次。

大小标准物的制备入多联体
1 .以TE缓冲液悬浮入
4 口g/40 口I 。

2. 用等体积TE配制的2%低熔点琼脂糖（温度保持在45C）混匀。

3. 移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。

4. 室温下用TE 及100 mmoI/L NaCI 溶液温育2天。

酵母染色体
1 .从YPD （酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入
10ml YPD预培养的肉汤中，30C下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，居9烈振荡24〜48h （产量大约100块）。

2. 4000Xg 转速，离心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris- HCl （pH7.5 溶液悬浮。

3. 仍以4000Xg转速离心10min，再用SCE[1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L 枸椽酸钠，pH5.8 及10 mmol/L 多联体（Boehringer MA 宝灵曼公司产品），浓度为
EDTA （pH7.5] 溶液重悬。

4. 取稀释后的细胞悬液用Neubauer 腔计数。

5. 溶液短暂离心后，再用SCE重悬细胞，使40口l SCE溶液中含5X 107 个细胞（相当于80 口l体积的模块中含有5X 107个细胞）。

6. 溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/L p -巯基乙醇混匀，37C 保温15〜30min。

7. 细胞悬液与等体积的SCE 配制的2％低熔点琼脂糖凝胶混匀，保持在50C。

8. 将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。

9 .凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE溶液37C下振荡温育1〜2小时。

10. 将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入
2mg/ml蛋白酶K , 50C温育48h 。

11. 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5 溶液洗涤凝胶块3 次，每次20min 。

12. 凝胶块可用此混合液于 4 C保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。

琼脂
糖凝胶块中DNA 的限制性内切酶消化
1 ．应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA 降解。

2. 在Falcon试管中用1X TE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去除EDTA。

3．混合：酶反应缓冲液（高、中或低盐缓冲液），100
mmol/L亚精胺（只用于高盐缓冲液状态），10〜20单位的内切酶。

20单位
的内切酶就足以过夜完全消化10卩g DNA
4 .设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA 降解。

5. 将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。

6．若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化（先用低盐缓冲液的酶消化，再调整盐浓度）。

倘若首次消化的酶要求50 C条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。

7．若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1：10 稀释的酶进
行尝试。

1. 将0.8 %的琼脂糖在0.25 X TBE中熔化后冷却至50〜60C，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。

2. 凝胶固化后小心地拔出齿梳，用
2 把无菌手术刀将DNA 凝胶块上样。

若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。

将DNA 大小标志物上样至凝胶的两旁。

3. 用1%液态低熔点琼脂糖凝胶（0.25X TBE 配制）密封狭槽。

4. 若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。

5. 一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约10min ），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。

6. 应设定合适的电压及转换时间（参考《分子医学技术》84页表8.1）并开
始电泳。

两个不同电泳方向的电流应相等。

7 .电泳结束后，凝胶用0.25 X TBE配制成的EB （0.4卩g/ml）染色。

8. 用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。

9. 凝胶成像：DNA 在曝光的过程中可能会形成缺口。

10. 用0.25mol/L HCl 漂洗凝胶30min ，让DNA 脱嘌呤，并有利于转移。

11. 凝胶用碱（变性溶液中）变性20min ，两次，续以中性溶液1〜5min
12．采用标准Southern 印迹方案将DNA 转印至尼龙膜上。

一般来说，印迹PFGE 凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长(约48h )。

脉冲场凝胶电泳( PFGE'S Agarose )
PFGE'S Agarose 有以下两种：
一、InCert 琼脂糖 -- 兆碱基片断DNA 制备获准使用的琼脂糖。

LONZA公司In Cert 琼脂糖
是一种极为有用的制备脉冲场凝胶电泳用染色体DNA 样品的低胶凝温度琼脂糖。

研究
证实InCert 琼脂糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA 的制备和限制性核酸内切酶消化。

应用：脉冲场凝胶电泳。

分析说明：胶凝温度(1.5%) :26 C — 30C
硫酸盐：冬0.15%凝胶强度(1.0% 400g/cm2
熔化温度(1.5%):冬70 C
湿度：冬10%
EEO(-Mr：＜0.10
二、SeaKem Gold琼脂糖
LONZA公司SeaKem Gold 琼脂糖
是一种高凝胶强度，低EEO ，标准胶凝温度的琼脂糖。

这种遗传学术级别
(Ge netic Tech no logy Grade , GTG)琼脂糖最适于脉冲场凝胶电泳法( pulsed field gel electrophoresis , PFGE )快速分辨Mb ( megabase ) ) 50kb-
10Mb ) DNA和常规电泳方法分辨1-50kb的DNA与PCR产物。

因其低EEO特性，SeaKem Gold琼脂糖中的DNA电泳迁移速度要显着的高于常规琼脂糖凝胶。

PFGE的跑胶时间依使用的缓冲液和琼脂糖浓度的不同可减少至原电泳时间的
50%。

因其高凝胶强度，即使是使用低浓度（0.5%）的SeaKem Gold 琼脂糖凝胶，操作处理依然很方便，从而允许在常规电泳中分离更大的DNA片断并减少PFGE中的DNA分离的耗时。

应用：脉冲场凝胶电泳；标准凝胶电泳分离大于23kb的DNA片断；Mb
大小DNA 印迹。

分析说明：
胶凝温度（1.5%）:34.5 C —37.5 C
硫酸盐：冬0.10%
凝胶强度（1.0% 1800g/cm2
凝胶强度（1.5%）:》3500g/cm2
湿度：冬10% EEO（-Mr : < 0.05
PFGE步骤1.脉冲电场凝胶电泳的DNA样品的制备
为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌（StapHylococcus
aureus 作为例子。