华南师范大学实验报告格式

华南师范大学实验报告

学生姓名黄淑兰学号20132501115

专业生物科学年级、班级13科一

课程名称分子生物学实验实验项目基因组DNA的提取、

电泳检测和DNA浓度测

定

实验类型□验证□设计□综合实验时间2016年3月25日

实验指导老师张铭光、梁山实验评分

实验四：基因组DNA的提取、电泳检测和DNA浓度测定

一、实验目的

1．理解真核生物基因组DNA提取的一般原理。

2．掌握基因组DNA提取的方法和步骤。

3．掌握DNA浓度、纯度的检测和计算方法。

二、实验原理

1．CTAB法提取纯化DNA的原理：阳离子去污剂的CTAB，可使细胞破裂，且在高离子强度的溶液(如>0.7mol/L NaCl)中，与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不沉淀核酸。通过有机溶剂（如苯酚、氯仿）抽提，使蛋白、多糖、酚类等杂质溶于有机相而被去除。氯仿可更好地去除水相中剩余的苯酚。NaAc的Na中和DNA的负电荷利于DNA聚集。CTAB具有从低离子强度溶液中沉淀核酸。乙醇使DNA变性沉淀，使核酸分离出来。

2．紫外分光光度法检测核酸的浓度、纯度的基本原理：嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(－C＝C一C＝C 一)，能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。核酸(DNA，RNA)的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照朗伯比尔（Lambert-Beer）定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸的含量。单链核酸（RNA）由于其碱基暴露，所以其吸光度较双链（DNA）高。在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。

三、实验材料、设备和试剂

1．材料：花椰菜

2．设备：移液器，高速离心机，水浴锅，培养箱，超微量紫外分光光度计，自动凝胶成像分析仪。

3．试剂：2% CTAB提取缓冲液，Tris-HCl (pH8.0)，NaCl ，EDTA，苯酚，氯仿，异戊醇，NaAc，乙醇，TE缓冲液(PH为8.0)，RNase

四、实验步骤

1．提取菜花基因组DNA：

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1）取菜花组织（体积如2黄豆），加入2ml CTAB抽提缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀浆2-3min，然后转移700ul的匀浆液至一支1.5ml离心管中，65℃水浴约45min。

2）加入700ul的氯仿/异戊醇（24:1），上下轻轻摇动2-3min。

3）12000g离心10min，取400~500ul上清液转移至一支1.5ml离心管中。

4）加入1/10体积的NaAc（3mol/L,pH5.2）40~50ul，轻轻上下颠倒混匀；然后再加入2倍体积的无水乙醇（1.0ml)，上下颠倒混匀。

5）加入100ulTE缓冲液（含50ug/ml RNase）轻弹管底，以溶解DNA。

6）将DNA溶液置于37 ℃水浴中30min（降解残留的RNA）。

2．基因组DNA电泳检测

1）胶液的制备：称取0.6g琼脂糖，置于100ml锥形瓶中，加入40ml 0.5×TBE稀释缓冲液，用刚用过的称量纸封口，微波炉里加热溶，取出摇匀成0.7%胶液。待胶冷却到60℃左右，加入DNA染料Goldview 1.8 ul，摇匀。

2）染料Goldview胶板的制备：戴手套将胶液倒入已插好16齿梳子的胶槽（大板）。凝固待用。

3）加样：5μl样品+ 2μl 6×loading buffer混匀，加入样品槽中，DNA Marker：5μlλ-EcoT14 I digest DNA 加入样品槽中，做对照。

3．基因组DNA浓度、纯度检测

1）取1μl样品，加人19μl TE无菌水，混匀待用。

2）取上述混匀的2μl样品，超微量紫外分光光度计检测。直接读取OD260值、OD280值、OD230值和DNA浓度并作记录。

3）计算OD260/OD280比值和OD260/OD230比值，判断DNA的纯度。

五、实验结果

1．电泳实验结果如下图一，M为marker电泳结果，2为本人实验电泳结果。

图一：基因组DNA电泳检测结果

2．超微量紫外分光光度计检测结果如下

OD280(abs) OD260(abs) OD320(abs) OD230(abs) OD260/OD280 OD260/OD230 DsDNA(ng/uL)

1 0.0905 0.3073 -0.1293 0.0796 3.3956 3.8617 21.8318

2 0.169 0.4642 -0.1282 0.1829 2.7461 2.5376 29.6215

3 0.3047 0.6711 -0.08 0.350

4 2.2027 1.9153 37.5556

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六、分析与讨论

1．基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

由结果可知，提取的DNA主带较清晰，表明提取物具有很好的完整性。发现4带是一条长带，可能原因是有杂质，或者DNA降解了，在提取基因组DNA时，基因组DNA会断裂成小的片断，所以在跑电泳时会存在一条主带（在提取效果比较好的情况下）。但是，因为不可能将RNA完全去除，和在提取时不可避免的将DNA打断为更小，所以会存在一条较长的拖尾，有些RNA去除不好的还会在比较小的位置存在一条带，那是没有除尽的RNA。拖尾的存在和基因组DNA提取的好坏有直接的关系。

2．基因组DNA浓度、纯度检测

在提取DNA实验过程中，选取的材料要新鲜，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB 抽提液充分混匀。收集CTAB与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难。同时为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈的搅拌、防止热变性，也要避免核酸降解酶类的降解。

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