分子标记技术

SSR标记技术和ISSR 标记技术雷世勇 2.1 SSR 标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。定义：SSR （全称为简单序列长度多态性标记）也称微卫星DNA ,是一类由几个多为1～5 个碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即 CA n和 TG n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。 SSR分子标记的应用举例

――鹅掌楸种属及杂种的分子标记北美鹅掌楸EST序列中开发的EST-SSR引物引物筛选物种特异性扩增引物特异性验证 SSR 标记技术的特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。SSR 标记的应用目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、

水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。 2.2 ISSR 标记技术 ISSR 即（内部简单重复序列）,是一种新兴的分子标记技术。它是建立在1994年发展的一种微卫星基础上的分子标记。已经广泛应用于各种动植物的品种鉴定、遗传图谱建立、遗传多样性的研究等方面。几个重要的名词： ISSR：他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。这类标记又被称为 ASSR或AMP-PCR。RAMP: 在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术。 ISSR分子标记的优点 2实验成本低； 3操作简单；4实验稳定性高； 5物种间通用； 6多态性较高； 1记录方便； 7精确度高； 8检测方便； 9开发费用低。 ISSR 标记技术原理：用于ISSR-PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR 可以检测基因组许多位点的差异。 ISSR的应用举例

――攀枝花苏铁遗传多样性的ISSR分析 PCR扩增及产物检测：从

所有引物中筛选出扩增条带晰、稳定性好、特异性强的引物对48个DNA 样品进行PCR扩增。引物筛选：从100个ISSR引物中筛选出扩增产物条带清晰的13条引物。遗传多样性分析：筛选出的13条引物共产生104条清晰条带，其中多态性条带94条，多态百分率为90.38% ，平均每个引物扩增条带数为8条。结果显示，ISSR 分子标记对攀枝花苏铁多样性的研究效果很好。第三代分子标记技术

章丽 SNP的检测方法测序法酶切法荧光PCR法 DNA芯片法质谱法分子标记技术的应用张文青丛峰遗传多样性（genetic diversity）一般指品种间及品种内个体在DNA水平上的差异。通过对遗传多样性的评估，可以了解品种的遗传结构及遗传关系。在经济动物育种过程中，可以准确地鉴定和筛选具有优良遗传变异的个体，这是育种工作的前提。在水产动物中，由于海洋生物生活环境的特殊性，要弄清海洋生物的遗传结构及遗传边界相对来说比较困难。但随着具有高多态性、分析过程快、位点丰富的DNA分子标记技术的出现，水产动物群体遗传学的分析变得简单快捷。

应用举例 AFLP分析大黄鱼野生种群和养殖群体养殖群体的多态片段比例和个体间的遗传差异度均低于野生种群，其遗传多样性水平较低，遗传变异贫乏。 2.RAPD技术对3个中国花鲈群体4个日本鲈鱼群体进行了遗传分化研究，结果进一步从分子水平上支持将中国产花鲈和日本的鲈鱼划分为2个种的观点，并且RAPD数据表明花

鲈和鲈鱼群体内都出现了明显的遗传分化。 3. 微卫星技术对东南亚海区鲈鱼进行分析，推翻了东亚地区只有1种鲈鱼的说法。在现代动物育种中，由于要利用各种亲属的表型信息，准确地系谱记录是十分重要的。在海洋生物育种中必须搞清楚亲子关系，这样才能利于根据亲属信息准确选留个体并能防止群体近交的发生。利用DNA分子标记位点的多态性，以多个标记位点在一定群体中各等位基因的频率为基础，计算父子关系相对机会 RCP 来进行血缘鉴定和血缘控制。应用举例 1.微卫星标记分析表明4个微卫星标记可以鉴定95％的后裔，5个微卫星座位的累积排除率可以达到96％以上，所以微卫星标记可以应用于中国对虾的家系鉴定。连锁图谱（linkage map），又称遗传图谱（genetic map）或遗传连锁图谱（genetic linkage map），是指基因或DNA分子标记在染色体上的相对位置。构建遗传图谱的意义：确定不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，为作物种质资源收集、目标基因定位、基因克隆、育种规模大小及相应育种方法的确定等提供理论依据。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是 DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有RFLP 限制性酶切片段长度多态性、RAPD 随机引物扩增多态性DNA 、AFLP 扩增片段长度多态性；80年代后出现的有STR 短串联重复序列，又称微卫星 DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP 单个核苷酸的多态性分析。绘制遗传连锁图谱的目的是要揭示动物所携带遗传信息的内容，准确确