同源重组的基因敲除
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理同源重组基因敲除，也称为转基因技术，是将两个基因上的片段截取到等位基因之外的 DNA 中，再重新组合到同一个基因上的一种技术。
这个过程也被称为基因敲除技术。
这种技术用于将特殊基因编码的蛋白质从生物体中组装起来，从而达到敲除某种特定的基因，或者研究新的突变和表型。
基因敲除技术可以将DNA片段连接在一起，并且可以融合多种中性拷贝来表达新的基因，这对于基因组结构研究非常重要。
基因敲除技术主要可以分为三类：突变型、常用片段融合型及同源重组型敲除技术。
常用片段融合型敲除技术是在目标基因中添加一个特异的连接头，从而使其具有隐藏的模式，抑制其功能。
而同源重组型敲除技术则是将两个基因的片段植入另一个片段的DNA中，使两个片段插入到一起，形成新的突变。
这些突变可以减弱目标基因的功能，从而屏蔽与此有关的特性或表型。
目前，学者们可以使用同源重组型敲除技术来研究特殊基因编码的蛋白质在生物体中的作用以及在病理、发育等过程中的调控机制。
而且，它还可以用来研究新的突变及其相关的表型，从而开展更多的生物学研究。
传统的同源重组方法，如DNA克隆、引物扩增PCR等，可以很好的实现相关的突变的敲除。
然而，随着生物素质技术的进步，细胞核酸和抗原之间的关系更加清晰。
利用CRISPR/Cas9及其衍生技术，可以有效地对基因组或蛋白质结构模糊位点进行控制，从而实现敲除特定染色体上的特殊基因或者研究新的突变及其相关表型。
同源重组基因敲除技术由其可靠性和卓越的灵敏度被广泛应用于许多生物学研究中。
这种技术可以增强基因上的特性，可以用来改变类型的基因的表观遗传性，可以从模式生物中删除特定的基因，从而探索这些缺失基因在生物体中扮演的角色。
它还可以使用在基因工程领域，有助于改变生物体的结构和功能，从而开发高效的药物等。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理引言随着基因工程技术的快速发展，人类对基因编辑和修饰的需求日益增加。
同源重组基因敲除是一种有效的基因编辑技术，可以精确地删除目标基因，进而研究其功能和影响。
本文将从基本原理、步骤以及应用场景等方面详细介绍同源重组基因敲除的原理。
基本原理同源重组基因敲除是一种人工改变生物体基因组的方法。
其基本原理是利用同源重组原理在特定基因位点引入外源DNA序列来替换目标基因或其部分序列。
这个外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因，用于筛选和鉴定敲除细胞。
在同源重组基因敲除中，通常选择目标基因的第一个外显子或关键区域进行敲除，以达到有效丧失目标基因功能的目的。
通过设计特异性的核酸引物，将外源DNA序列与目标基因特定区域相结合，通过同源重组来替代目标基因。
步骤同源重组基因敲除包括以下几个关键步骤：1.设计外源DNA序列：根据目标基因序列，设计与目标基因特定区域同源的外源DNA序列。
外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因。
2.制备敲除载体：将设计好的外源DNA序列插入到敲除载体中。
敲除载体通常是由质粒构建而成，具有选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以方便后续筛选。
3.细胞转染：将敲除载体导入目标细胞内。
转染方法有多种，包括化学法、电穿孔法和病毒介导转染法等。
转染后，对细胞进行培养和筛选。
4.筛选敲除细胞：根据选择性标记基因的特性，可使用对应的抗生素或其他筛选条件来选择敲除细胞。
只有敲除了目标基因的细胞才能存活下来，形成筛选突变株。
5.鉴定敲除细胞：通过PCR、Southern blot等分子生物学方法对转染细胞进行鉴定。
PCR扩增特定区域并进行测序分析，可确认目标基因是否被成功敲除。
应用场景同源重组基因敲除技术在基因编辑领域具有广泛的应用前景。
以下是该技术在一些应用场景中的具体应用：1.基因功能研究：同源重组基因敲除可以用于研究基因的功能和调控机制。
通过敲除特定基因，观察编辑细胞或生物体的表现差异，从而揭示该基因对生物体的重要性和功能。
基因敲除技术的原理和应用
基因敲除技术是一种基因编辑技术，通过这种技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究基因的功能和作用机制。
基因敲除技术的原理：
1. 基因敲除可以通过同源重组的方法实现。
具体来说，研究人员将一个含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过同源序列的识别和同源重组将待编辑的基因删除。
2. 另一种基因敲除方法是随机突变。
研究人员将含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过随机突变的方法产生突变体。
基因敲除技术的应用：
1. 研究基因的功能和作用机制。
通过基因敲除技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究该基因的作用和影响。
2. 疾病治疗。
基因敲除技术也可以用于治疗某些疾病，如遗传性疾病、癌症等。
3. 药物开发。
研究人员可以通过基因敲除技术来研究药物的作用机制和效果，以开发新的药物。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除是一种基因编辑技术，用于通过删除特定基因的方法来研究该基因的功能。
该技术依赖于同源重组（homologous recombination）的原理，即通过引入一个与目标基因相似但存在缺陷的DNA片段，使其与目标基因发生交换，从而使目标基因的序列被“剪除”。
同源重组基因敲除的过程可以简单概括为以下几个步骤：
1. 构建敲除基因载体：首先，需要构建一种含有目标基因的缺陷的 DNA 片段的敲除基因载体。
这个载体通常包括两个关键
部分：一个能够与目标基因进行同源重组的“同源臂”，以及一个“筛选标记”以区分带有敲除基因的细胞。
2. 转染细胞：将敲除基因载体导入目标细胞中。
这可以通过多种方法实现，如基因枪、电穿孔或病毒介导等。
3. 同源重组：在目标细胞内，敲除基因载体中的同源臂与目标基因的相应部分发生同源重组，并在此过程中将缺陷的片段插入到目标基因的位置。
4. 筛选转基因细胞：为了筛选那些已经发生同源重组的细胞，通常会在敲除基因载体中加入一个筛选标记，如抗生素的抗性基因。
只有那些发生重组的细胞才能生存下来，因为它们可以在含有相应抗生素的培养基上生长。
通过同源重组基因敲除技术，可以实现有针对性地敲除特定基
因的目的。
这种方法广泛应用于功能基因组学研究，为我们理解基因的功能和相互作用提供了重要的工具。
基因敲除同源重组方法
基因敲除同源重组方法
哇塞，基因敲除同源重组方法，这可真是个超厉害的生物技术手段呢！
首先来说说它的步骤和注意事项哈。
一般呢，先得设计针对目标基因的同源臂，这就像是给基因做手术准备的精准工具。
然后把这些同源臂和筛选标记等构建到载体上，就像给工具找个合适的盒子装起来。
接着把这个载体导入到细胞中，让它们去发挥作用。
这里要注意载体的质量和导入的效率哦，可不能马虎。
在筛选的时候也要仔细，确保得到的是真正敲除了目标基因的细胞。
再说说这个过程中的安全性和稳定性。
其实啊，只要操作规范，安全性还是挺高的。
就像走在一条规划好的路上，只要不偏离轨道，就不会出大问题。
而且这个方法的稳定性也不错，一旦成功敲除，一般都能稳定遗传下去呢，这多让人放心呀！
那它的应用场景和优势可就多啦！可以用来研究基因的功能，这就好比是揭开基因这个神秘宝库的钥匙。
还能用于疾病模型的建立，为治疗疾病提供重要的线索和依据。
它的优势就是准确性高呀，能精确地敲除目标基因，这可太牛了！
比如说在癌症研究中，通过基因敲除同源重组方法，科学家们成功地研究了某些与癌症发生发展密切相关的基因，为癌症的治疗找到了新的方向。
这效果，简直太棒啦！
我觉得基因敲除同源重组方法真的是生物技术领域的一颗璀璨明星呀！它为我们探索生命的奥秘、解决疾病难题提供了强大的工具和手段，让我们对未来充满了希望！。
同源重组敲除基因步骤
同源重组敲除基因步骤第一步：设计构建同源重组敲除基因的构建体1.选择目标基因：确定要敲除的目标基因，通常选择对细胞或个体生存具有重要作用的基因。
2.设计修饰子：通过设计修饰子使目标基因发生敲除。
常用的修饰子包括启动子，转录终止子，脱氧核苷酸连接位点和选择标记等。
3.构建构建体的载体：选择合适的载体，将修饰子和选择标记序列连接在一起，构建构建体的载体，通常为质粒或病毒载体。
第二步：构建构建体的DNA片段1.文库筛选：根据目标基因的序列，选择合适的文库进行筛选，以获取包含目标基因首尾序列的克隆。
2.PCR扩增：使用目标基因的首尾序列为引物，进行PCR扩增，得到目标基因的DNA片段。
3.克隆目标基因：将PCR扩增的目标基因的DNA片段连接到构建体的载体上。
第三步：构建转基因动物胚胎干细胞库1.培养胚胎干细胞：从小鼠或其他动物的胚胎中分离胚胎干细胞，并在适宜培养基中进行培养。
2.转染构建体：使用适当的转染技术将构建体转染到胚胎干细胞中。
3.筛选转染细胞：通过筛选选择已经内含构建体的胚胎干细胞进行下一步的实验操作。
第四步：构建敲除基因小鼠模型1.筛选胚胎干细胞：将筛选出的含有构建体的胚胎干细胞注入到小鼠的早期胚胎中。
2.基因敲除小鼠的获取：将经过注射的早期小鼠胚胎移植到代孕母鼠的子宫中，等待小鼠的出生。
出生后通过PCR检测小鼠的基因是否被敲除。
第五步：分析敲除基因小鼠1.分离小鼠基因组DNA：从小鼠的组织或细胞中分离基因组DNA。
2. 使用PCR或Southern blotting等方法检测是否敲除基因：利用PCR或Southern blotting等分子生物学方法检测小鼠组织或细胞中目标基因是否被敲除。
3.表型分析：通过对敲除基因小鼠进行行为学、生理学、病理学或其他实验方法的分析，评估目标基因对小鼠表型的影响。
以上是同源重组敲除基因的主要步骤。
通过这些步骤可以对目标基因进行敲除，进而研究其功能以及生成相应的基因敲除动物模型，从而更深入地了解基因的生物学功能与作用机制。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理同源重组技术是一种常用的基因编辑方法，它可以通过精确地改变某一特定基因的序列，从而实现对该基因的敲除或修饰。
同源重组基因敲除原理是基于DNA双链断裂修复机制的原理，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
下面我们将详细介绍同源重组基因敲除的原理及其应用。
首先，同源重组基因敲除的原理是基于DNA修复机制的。
在细胞中，DNA双链断裂是一种常见的DNA损伤形式。
细胞会通过两种主要的修复途径来修复这种损伤，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。
在同源重组修复过程中，细胞会利用同源DNA片段来修复断裂的DNA，从而实现对目标基因的敲除或修饰。
其次，同源重组基因敲除的实现需要引入外源DNA片段。
这些外源DNA片段通常包含有与目标基因相同或相似的序列，以便在同源重组修复过程中与目标基因发生配对。
一旦发生同源重组，外源DNA片段会替代目标基因的部分或全部序列，从而实现对目标基因的敲除。
同源重组基因敲除技术在基因编辑领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能。
通过敲除特定基因，研究人员可以了解该基因在生物体内的功能及其对生物体的影响，从而揭示基因与生物性状之间的关系。
其次，同源重组基因敲除还可以用于生物工程和生物医学研究。
研究人员可以利用这一技术来改良农作物、动物，甚至进行基因治疗，为人类健康和农业生产提供新的解决方案。
总之，同源重组基因敲除是一种重要的基因编辑技术，它基于DNA修复机制，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
这一技术在基因功能研究、生物工程和生物医学研究等领域有着广泛的应用前景。
随着基因编辑技术的不断发展，同源重组基因敲除技术将为人类社会带来更多的福祉和进步。
同源重组敲除基因原理
同源重组敲除基因原理同源重组敲除基因原理：1.定义：同源重组敲除基因是一种基因组学技术，它利用某种特定的同源变异（homologous recombination）来删除或编辑特定的基因，在某种生物体中去除目标基因，或者在另一种生物体中添加这种基因。
2.原理：♦同源重组是指基因组DNA发生的一种自然的进化过程，它在不同的序列之间发生地很慢。
♦同源重组有两种类型：消加交换（deletional crossover）和倒位交换（inversion crossover），可以交换整段基因的片段，从而改变基因的组成或结构；或是更小范围的单碱基替换。
♦通过CRISPR-Cas9等基因编辑工具，研究者可以用"变异后"和"变异前"基因的序列，把这两种被改变的序列重新组合在一起，从而让变异后的序列进行重组敲除处理，可以删除或修改对应的基因。
3.应用：♦同源重组敲除技术在基因组学中广泛应用。
研究者可以用它来分离基因型，搜索遗传病形成机制，研究某一分子功能，或者研究同源重组在生物进化中发挥的作用。
♦同源重组敲除技术也可以用来研究基因之间的互作。
由于 CRISPR-Cas9 技术对对靶基因的高精确编辑，使其可以用来检验在功能性分析中，多个基因之间的相互作用。
4.优势：♦同源重组敲除基因技术的最大优势在于能够精确的编辑基因，而不会破坏原有的基因序列。
♦另外，CRISPR-Cas9基因编辑技术低成本、效率高、作用范围广泛，可以对很多种基因组编辑，所以同源重组敲除可以在一键之间对原材料进行多种基因组编辑修改。
5.缺点：♦同源重组敲除基因技术也存在着一定的不足，比如它通常仅仅能改变一种特定基因，或是受到基因序列的限制，很难实现对多个基因的同时编辑；♦另外，该技术仍然具有很大的实验难度，研究者需要用不同种类的原材料来构建正确的CRISPR-Cas9系统，这一步骤显得比较繁琐且容易出错。
同源重组三亲结合基因敲除原理
同源重组三亲结合基因敲除原理咱先来说说啥是基因敲除哈。
你可以把基因想象成是一个超级小的、但是超级重要的小零件，这个小零件在生物这个大机器里有着特定的功能呢。
基因敲除就像是一个调皮的小工匠，把这个小零件给拿掉或者修改了，然后看看生物这个大机器会发生什么有趣的变化。
那同源重组三亲结合又是怎么一回事呢？这里面有三个“小伙伴”哦。
第一个小伙伴是含有待敲除基因的目标菌，这个目标菌就像是一个小城堡，里面住着我们想要捣鼓的基因。
第二个小伙伴是带有可移动元件（比如说质粒之类的东西）的供体菌。
这个供体菌可厉害了，它带着一些特殊的工具，就像是一个小魔法师，带着能改变目标菌基因的魔法棒。
第三个小伙伴是辅助菌，这个辅助菌就像是一个小助手，它能帮助供体菌把它的魔法棒（可移动元件）传递给目标菌呢。
当这三个小伙伴凑在一起的时候，就像是一场奇妙的聚会。
供体菌的可移动元件里面有着和目标菌待敲除基因同源的序列。
啥是同源序列呢？就像是两个长得很像的小图案，它们有着相似的结构。
这个可移动元件就会利用这种相似性，像一把精准的小钥匙一样，找到目标菌里对应的基因位置。
然后啊，这个可移动元件就开始在目标菌里搞事情啦。
它通过同源重组的方式，把目标菌里原来的基因给替换掉或者破坏掉。
这就好比是在城堡里，把原来的一块小砖头（基因）换成了一块不一样的砖头，或者直接把这块砖头给敲碎了。
这个过程中，目标菌的基因就被敲除啦。
你可能会想，这有啥用呢？用处可大了去了。
比如说我们想知道某个基因是管着生物长眼睛的，如果我们把这个基因敲除了，然后发现生物不长眼睛了，那我们就知道这个基因对眼睛的生长是超级重要的。
这就像是我们在玩一个超级复杂的解谜游戏，基因敲除就是我们解谜的一个小手段。
而且哦，同源重组三亲结合这种方式相对来说比较精准呢。
它不是那种乱打乱撞的改变基因的方法，而是靠着同源序列这种小暗号，准确地找到目标基因。
这就像是我们去朋友家，靠着门牌号（同源序列）准确地找到他家一样。
1. 同源重组在G+球菌基因敲除中的运用
同源重组在细菌基因敲除中的运用
• 基因功能研究方法
– 计算机预测基因功能 – 基因失活
• 基因敲除knock out • 转座子插入突变 • 反义RNA技术（RNA沉默）：knock down
– 基因过表达（over-expression） – 酵母双杂交（yeast two-hybridization）
细菌的生物学特点
• • • • • 个体微小 结构简单：单细胞生物 易于培养 繁殖快：代时仅20-30min 具有一条染色质（无内含子），单倍型
• 细菌是生命科学研究重要的模式生物
细菌的遗传变异现象
• 遗传（heredity): 子代与亲代之间生物学 性状具有相似性。使细菌的性状保持相对 稳定，且代代相传，使其种属得以保存。 • 变异(variation)：在一定条件下，若子代 与亲代或子代与子代之间的生物学性状出 现差异。变异使细菌产生变种和新种，以 利于细菌的生存及进化。
表皮葡萄球菌saeRS敲除
4. 运用pKOR1质粒敲除G+球菌基因
Map of pKOR1
pKOR1质粒特点
• A replacement plasmid that employs antisense secY RNA expression (secY expression are essential for bacterial growth and survival) for counter-selection （obviated the need for antibiotic marker selection） • The lambda recombination cassette (Invitrogen) is another feature of pKOR1 that permits rapid cloning of mutant alleles without the use of restriction enzymes and ligases
基因敲除-简介
用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目
的(gene knock-out)。
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister
chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重
新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、 RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11Rad50等等。
glrA
Ta
actin
Ta
hph
glrA
ble
3.9 kb
RT-PCR验证∆glrA及cglrA菌株
影响因素
细菌的限制性修饰系统。
合适的选择性标记。 高效的转化技术(CaCl2法、电转化、原生质体、结合转 移、农杆菌介导的转化）。
Thanks!
1、建立高效的遗传转化系统。
2、构建基因敲除载体（最好带有双标记）。
3、转化实验。
4、筛选基因敲除的转化子。
5、验证转化子。
构建glrA 基因缺失株、遗传互补株和高表达菌株
PCR 2 (2.67 Βιβλιοθήκη b)∆glrA ∆glrA
WT
WT
NC
PCR 1 (1.52 kb)
NC
Ladder
3 kb 2 1.6 1
除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成 功的有基因的插入突变(insertional mutagenesis) 和RNAi
(gene knock-down) 。
a.基因载体的构建
把目的基因和与细胞 内靶基因特异片段同源 的DNA 分子都重组到带 有标记基因的载体上， 成为重组载体。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理同源重组技术是一种利用外源DNA片段替代内源DNA片段的方法，可以精确地改变目标基因的序列。
在基因敲除研究中，同源重组技术被广泛应用，可以实现对特定基因的精准敲除，从而揭示基因在生物体内的功能和作用机制。
本文将介绍同源重组基因敲除的原理及其在基因功能研究中的应用。
同源重组基因敲除的原理主要包括以下几个步骤，选择目标基因、构建敲除载体、细胞转染、筛选敲除细胞和验证敲除效果。
首先，选择目标基因是同源重组基因敲除的第一步，需要根据研究的目的和需求选择合适的基因作为敲除靶点。
其次，构建敲除载体是同源重组基因敲除的关键步骤，需要将外源DNA片段插入到载体中，构建成能够与目标基因发生同源重组的敲除载体。
然后，将构建好的敲除载体通过细胞转染技术导入到目标细胞中，使其发生同源重组。
接着，通过对转染细胞进行筛选，筛选出发生了同源重组的敲除细胞。
最后，验证敲除效果是同源重组基因敲除的最后一步，需要通过分子生物学技术对敲除细胞中的基因进行验证，确认敲除效果是否达到预期。
同源重组基因敲除技术在基因功能研究中有着广泛的应用。
首先，通过敲除特定基因，可以揭示该基因在生物体内的功能和作用机制。
例如，科研人员可以敲除小鼠中的特定基因，观察敲除小鼠的表型变化，从而推断该基因在小鼠生长发育、疾病发生等方面的作用。
其次，同源重组基因敲除技术还可以用于疾病模型的构建。
通过敲除与某种疾病相关的基因，可以构建动物模型，用于研究该疾病的发病机制和药物治疗效果。
此外，同源重组基因敲除技术还可以用于农业生物技术领域，例如改良作物品种、培育抗病虫害的转基因作物等。
总之，同源重组基因敲除技术是一种重要的基因编辑技术，可以精准地敲除特定基因，揭示其在生物体内的功能和作用机制。
在基因功能研究、疾病模型构建和农业生物技术等领域有着广泛的应用前景。
随着基因编辑技术的不断发展和完善，同源重组基因敲除技术将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用，为人类健康和农业生产提供更多的可能性。
同源重组基因敲除的流程
同源重组基因敲除的流程同源重组基因敲除，这可是个超有趣的基因操作呢。
一、什么是同源重组基因敲除。
简单来说，就是一种对基因进行改造的方法。
我们就像基因世界里的小魔法师，想要去掉某个基因，就会用到这个技术。
想象一下，基因就像一串长长的项链，而我们要敲除的那个基因就是项链上一颗我们不想要的珠子。
通过同源重组的魔法，我们就能精准地把这颗珠子拿掉啦。
这种技术在研究基因功能的时候可太重要了，就好比我们想知道汽车上某个零件有啥用，那就把这个零件拿掉看看汽车会怎么样，对于基因也是同样的道理哦。
二、准备工作。
要进行同源重组基因敲除，那可得好好准备一番呢。
1. 我们得先找到要敲除的目标基因呀。
这就像在一大群小伙伴（众多基因）里找到那个我们想要捉弄（敲除）的特定小伙伴一样。
这个目标基因得是我们已经研究过，知道大概功能或者是我们特别好奇想知道它功能的基因。
2. 构建打靶载体可是个技术活。
这就像是打造一把专门的钥匙，这个钥匙得和我们要敲除的基因所在的那段“基因锁”匹配得严丝合缝。
这个打靶载体通常包含有和目标基因两端同源的序列，这就好比钥匙的齿要和锁孔形状完全一样才能插进去。
3. 细胞的选择也很关键呢。
不同的细胞就像不同的小房子，有些小房子适合做这种基因敲除的实验，有些就不太合适。
我们得选择那些容易接受外来“改造”，而且在培养的时候比较听话的细胞，就像我们要找那些性格好、容易相处的小伙伴一起玩游戏一样。
三、基因敲除的实际操作。
1. 把构建好的打靶载体导入到我们选好的细胞里。
这一步就像是把我们打造好的特殊钥匙送到小房子（细胞）里去开锁。
导入的方法有好多种呢，像电穿孔法，就像是给细胞通了一下电，让细胞开个小缝，好让打靶载体进去；还有脂质体转染法，这就好比给打靶载体穿上一件特制的“小外套”，这个外套能和细胞的细胞膜很友好地融合，然后带着打靶载体就进去细胞啦。
2. 一旦打靶载体进入细胞，同源重组就开始发生了。
这时候细胞内部就像一个小小的战场，打靶载体上的同源序列会找到目标基因，然后进行交换，就像两个战士在交换武器一样。
基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些？
基因敲除技术的主要⽅法和步骤有哪些？基因敲除是⽤含有⼀定已知序列的DNA⽚段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发⽣同源重组，整合⾄受体细胞基因组中并得到表达的⼀种外源DNA导⼊技术。
它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变⽣物遗传基因，令特定的基因功能丧失，从⽽使部分功能被屏蔽，并可进⼀步对⽣物体造成影响，进⽽推测出该基因的⽣物学功能。
⽬前能实现基因敲除的⽅法有：1.运⽤基因同源重组进⾏基因敲除(1)步骤⽅法A 构建基因载体：把⽬的基因和与细胞内靶基因特异⽚段同源的DNA 分⼦都重组到带有标记基因的载体上，使之成为重组载体，常⽤的标记基因有：neo 基因、TK 基因等。
根据实验⽬的不同，打靶载体分为全基因敲除、条件敲除、基因敲进、诱导性基因敲除等打靶载体。
B获得胚胎⼲细胞：现在基因敲除⼀般采⽤是胚胎⼲细胞，最常⽤的是⿏，⽽兔、猪、鸡等的胚胎⼲细胞也有使⽤。
基因敲除⼀般应⽤于⿏，常⽤的⿏的种系是129及其杂合体，因为这类⼩⿏具有⾃发突变形成畸胎瘤和畸胎⾁瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
有些科研机构和单位已经运⽤C57BL/6遗传背景的⼩⿏的胚胎⼲细胞进⾏基因打靶，⼴泛运⽤于免疫学、神经学、癌症等领域。
C同源重组：将重组载体通过⼀定的⽅式(电穿孔法或显微注射)导⼊同源的胚胎⼲细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎⼲细胞基因组中相应部分发⽣同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从⽽得以表达。
⼀般来说，显微注射命中率较⾼，但技术难度较⼤，电穿孔命中率⽐显微注射低，但操作便利。
D筛选已表达的细胞：由于基因转移的同源重组⾃然发⽣率极低，因此要从众多细胞中筛出真正发⽣了同源重组的胚胎⼲细胞。
⽬前常⽤的⽅法有：正负筛选法(PNS法)、标记基因的特异位点表达法以及PCR 法，其中应⽤最多的是PNS法。
E 性状观察：通过观察重组⼩⿏的⽣物学形状的变化进⽽了解⽬的基因变化前后对⼩⿏的⽣物学形状的改变，达到研究⽬的基因的⽬的。
利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法
利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法基因敲除是一种使特定的基因失活或缺失的技术，它可以用来研究基因的功能和表型。
基因敲除的一种常用方法是利用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
然而，这种方法并不总是有效，有时候细胞会利用非同源末端连接机制来修复DNA双链断裂，从而导致不可预测的突变或损伤。
本文将介绍利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法，以及它们的优缺点和影响因素。
同源重组同源重组是一种利用未受伤的姐妹染色单体或者人工提供的供体模板作为修复模板的方式，它可以保持基因组的完整性和稳定性。
同源重组主要发生在S期或G2期，当细胞有两份相同或相似的染色单体时。
同源重组的步骤如下：•首先，细胞需要将双链断裂的末端进行修剪，产生3’单链DNA（ssDNA），这个过程需要MRN复合物（由Rad50、Mre11和Nbs1组成）和转录因子CtIP（CtBP-interacting protein）等蛋白质的参与。
•然后，ssDNA被复制蛋白A（Replication protein A，RPA）包被，使其免受核酸酶的降解，并去除二级结构。
•接着，由BRCA2蛋白介导，RPA被重组酶RAD51替换，形成核蛋白丝寻找姐妹染色单体上或供体模板上的同源序列。
•最后，RAD51蛋白介导侵入DNA双链模板，并与同源DNA序列配对形成D-Loop结构，D-Loop延伸或与另一个末端连接，完成修复过程。
利用同源重组实现基因敲除的方法是设计一个与目标基因有一定同源性但也有一些差异的供体模板，比如在其中插入了一个标记基因或者删除了一个关键片段。
这样，当细胞利用同源重组机制来修复双链断裂时，供体模板会与双链断裂的末端配对，并将修改过的目标基因整合到细胞基因组中，从而达到基因敲除的目的。
利用同源重组实现基因敲除的优点是可以精确地替换或插入目标基因，不会引入额外的突变或缺失。
同源重组原理的基因敲除
同源重组原理的基因敲除同源重组原理是指在相同基因家族中存在有相似的基因序列，在细胞发育或疾病发生过程中，通过交叉互换和基因重组的方式，产生新的基因序列和突变。
同源重组原理的基因敲除是指通过特定方法使某一特定基因失去功能，从而研究该基因在细胞、组织或整个生物体中的作用、功能和调控机制。
同源重组原理的基因敲除方法主要有两种，一种是传统的基因敲除方法，另一种是CRISPR/Cas9系统。
传统的基因敲除方法是通过基因转座，引导同源重组技术来实现基因敲除。
基因转座是指基因序列从一个部位移到其他部位的过程。
以酵母为例，可以构建一个含有基因敲除所需片段的DNA质粒，并通过大量的复制使其进入靶基因的基因座位，然后利用同源重组方式使这个基因座排挤原基因，从而实现基因敲除。
这种方法的优点是简单易行，但存在着一些问题，如基因敲除效率低、通过杂合性培养获取敲除株困难等。
CRISPR/Cas9系统是一种新出现的基因编辑技术，通过修改CRISPR序列和Cas9蛋白使其成为靶向特定基因的工具。
CRISPR序列是一种存在于原核细菌和古细菌基因组中的一段重复序列，与Cas9蛋白一起组成CRISPR/Cas9系统。
Cas9蛋白具有核酸酶活性，可以识别和切割特定的DNA序列。
通过设计合成特异性的CRISPR序列和构建指向目标基因的合适sgRNA（single guide RNA），CRISPR/Cas9系统可以实现高效、准确的基因敲除。
CRISPR/Cas9系统的基因敲除步骤为：首先是设计和合成与目标基因靶向序列相对应的sgRNA，并将其与Cas9蛋白复合；然后将sgRNA和Cas9蛋白复合体导入到细胞中，靶向特定基因的DNA序列；接下来，Cas9蛋白将sgRNA引导到目标基因上，并通过识别和切割目标基因的DNA序列导致其断裂；最后，细胞通过自身修复机制修复断裂的DNA片段，导致错误的连接和缺失，从而使目标基因失去功能。
基因敲除的应用非常广泛。
同源重组的基因敲除
RECOMBINATION
第一次重组
A、B为一段DNA序列，并非是基因
A
A1 A2
目的基因
B
a1
a2
a
构建质粒 b
A1
a2
b
a1
A2
目的基因
B
第二次重组的第一种情况 A1 a2
b
a1
A2
目的基因
B
b A1 a2 b1 b2 a1 A2
目的基因
B2
B1
B
A1 a2 b1 B2 目的基因 a1 A2
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的 发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
实验目的： 在P.Putida KT2442基因组中敲掉目的基因
phaC1-phaZ-phaC2,检测不同phaC基因的特 异性
运用原理：同源重组的基因敲除
Abstract
Pseudomonas putida KT2442 could accumulate medium-chainlength poly(hydroxyalkanoate)s (PHA) consisting of 3hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate from a wide range of carbon sources. In this study, the PHA synthase pha operon (phaC1-phaZ-phaC2) was knocked out and the vgb gene encoding vitreoscilla hemoglobin protein (VHb), which could enhance oxygen uptakerate especially at low oxygen concentration, was integrated into the P. putida KT2442 genome to replace the deleted fragment. The resulting mutant P. putida KTOY01 or gene-replaced mutant KTOY02 was used as the host to study PHA synthase properties and PHA production. Different PHA polymerase (PhaC) genes, phaCRe from Rastonia eutropha H16, phaCAc from Aeromonas cavie, and phaC2Ps from
同源重组双交换原理基因敲除
同源重组双交换原理基因敲除一、同源重组原理同源重组是指两个染色体上的相同区域发生交换，交换的两个染色体必须来自于同一个亲本。
同源重组是常见的染色体遗传现象之一。
1.1 同源染色体同源染色体是指来自不同亲本但具有相似基因序列的两条染色体，它们在大小、形态和基因排列方面都相似。
人类有23对同源染色体。
1.2 交叉互换交叉互换是指发生在同源染色体上的交换现象。
在减数分裂中，配子形成前，同源染色体间会发生互换，使得每个配子都包含来自母本和父本的遗传物质。
1.3 同源重组原理在减数分裂中，当两条同源染色体上的相似区域发生交叉互换时，就会产生新的组合形式。
这种现象被称为同源重组。
二、双交换原理双交换原理是指在一对杂合子中，如果两个位点A和B位于不同的染色体上，则它们之间存在独立分离和随机联合关系。
这意味着，位于不同染色体上的两个基因在遗传过程中是相互独立的。
2.1 杂合子杂合子是指一个个体拥有两个不同等位基因的情况。
例如，在人类中，如果一个人的父母分别是Aa和Bb，则该人就是AB杂合子。
2.2 独立分离独立分离是指在一对杂合子中，两个位点A和B之间的遗传关系是相互独立的。
例如，在一个AaBb杂合子中，位于不同染色体上的A和B基因会随机分配到不同的配子中。
2.3 随机联合随机联合是指在一对杂合子中，两个位点A和B之间的遗传关系是随机组合的。
例如，在一个AaBb杂合子中，由于A和B基因在遗传过程中相互独立，所以会出现AB、Ab、aB和ab四种可能性。
三、基因敲除基因敲除是指通过技术手段使得特定基因失去功能或被删除。
这种技术可以用来研究特定基因在生物体发育、生长、代谢等方面所起到的作用。
3.1 RNA干扰技术RNA干扰技术是一种常见的基因敲除技术。
它是通过引入特定的RNA 分子，来抑制目标基因的表达。
RNA干扰技术可以用于研究基因在生物体发育、生长、代谢等方面所起到的作用。
3.2 CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术。
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3.RNA干扰引起的基因敲除
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进 化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效 特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上 由双链RNA诱发的基因沉默现象。所以RNAi的反应过 程也可以用于基因敲除。
反转录病毒转染法：把含有重组的逆转录病毒载体病毒颗粒去感染卵 裂期胚胎，于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中，整合 到宿主细胞的染色体上。
体细胞核移植
二、基因敲除技术
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。
2、利用随机插入突变进行基因敲除 3、RNA干扰也可以引起基因敲除
摘自《中华医学信息》 2007年第22卷第21期
文献：
Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的 发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
基因敲除技术与诺贝尔奖
医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了 卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们 是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的 Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授
Pseudomonas stutzeri 1317, were expressed in the mutant strains to test the PhaC enzyme substrate specificity. The result showed P. putida KTOY01 or KTOY02 could provide not only mcl PHA monomers but also 3-hydroxybutyrate from fatty acids, which may allow the production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA). Plasmid pCJY10 containing phaC2Ps, phbA, and phbB genes encoding PHA polymerase, b-ketothiolase, and acetoacetyl-CoA reductase, respectively, were transformed into P. putida KTOY01 and KTOY02. Shake-flask culture showed P. putida KTOY01 or KTOY02 (pCJY10) could accumulate poly(3HB-co-mcl 3HA) from glucose. The above result showed pha operon knockout mutant of P. putida KT2442 was a very useful host of great potential not only for studying PhaC synthase, but also for microbial production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA), which is very difficult to abtain.
Байду номын сангаас
1、微生物中的基因转移
转化
转导
接合
溶原性转换
原生质体融合
2、植物转基因技术
农杆菌介导转化法：根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti 质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入 细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
基因枪介导转化法：利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被 称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入 完整的植物组织和细胞中。
1． 利用基因同源重组进行基因敲除
应用最为广泛
其具体的原理和应用将在后面重点介绍
2.利用随机插入突变进行基因敲除 ——基因捕获法
利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因 载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携 带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获 得相应的基因敲除细胞。
转基因和基因敲除技术介绍
张 晓 军 刘 杰 魏 岱 旭
主要内容
转基因技术 基因敲除技术 文献
一、转基因（Transgenesis）技术
定义：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中， 由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的 技术
微生物中的基因转移 植物转基因技术 动物转基因技术
实验目的： 在P.Putida KT2442基因组中敲掉目的基因
phaC1-phaZ-phaC2,检测不同phaC基因的特 异性
运用原理：同源重组的基因敲除
Abstract
Pseudomonas putida KT2442 could accumulate medium-chainlength poly(hydroxyalkanoate)s (PHA) consisting of 3hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate from a wide range of carbon sources. In this study, the PHA synthase pha operon (phaC1-phaZ-phaC2) was knocked out and the vgb gene encoding vitreoscilla hemoglobin protein (VHb), which could enhance oxygen uptakerate especially at low oxygen concentration, was integrated into the P. putida KT2442 genome to replace the deleted fragment. The resulting mutant P. putida KTOY01 or gene-replaced mutant KTOY02 was used as the host to study PHA synthase properties and PHA production. Different PHA polymerase (PhaC) genes, phaCRe from Rastonia eutropha H16, phaCAc from Aeromonas cavie, and phaC2Ps from