2014年版单扩实验讲义

实验单向免疫扩散(Single immunodiffusion) 一、基本原理

免疫沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定量试验。一般是用已知抗体测定未知量的相应抗原。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，单向免疫扩散实验常稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。因此通常是把抗体先混合在琼脂中，以不同稀释度的抗原在琼脂中扩散。将定量抗体与熔化的含缓冲液的琼脂均匀混合，倾注平板，凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入待检抗原溶液，放室温或37℃让其自由扩散，24-48h后，可见孔的周围出现沉淀环。抗原在一定范围内，沉淀环的直径与抗原的量成正相关，因而可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体）的量。单向免疫扩散试验是一种定量试验，主要用于血清中免疫蛋白（IgG、IgM、IgA）含量的测定。

单向免疫扩散示意图

二、材料与器材

(一)抗体：标准羊抗人IgG单价抗血清（抗体）（商品有售）。

(二)抗原：①工作标准参考蛋白（IgG，含量10mg/ml）（参考血清）（商品有售），

②人全血清（作为待测血清），

(三)生理盐水（采用0.9%的生理盐水），

(四)其他用品：打孔器（孔径3mm），微量加样器（10微升），小离心管、载玻片、湿盒、量尺、水浴箱等。

三、实验方法

（一）标准曲线的制备：

（１）制备含抗体的琼脂凝胶板：

A、制胶：用生理盐水配制1.5%琼脂糖凝胶，微波炉中煮沸熔化至澄清后，移置56℃水浴箱中保温备用。量取56℃的熔化琼脂置小烧杯内，加入氨苄青霉素（200μl/ml），和羊抗人IgG抗体（1︰60，v/v）充分混合，继续保温于56℃水浴中备用。

另再制备不加抗体与氨苄青霉素的1.5%琼脂凝胶50ml，煮沸熔化至澄清。亦保温于56℃水浴备用。

C、铺胶：用针管吸取溶化的琼脂4ml趁热均匀浇注于干净的载玻片上，厚度约为1.5mm。室温冷却凝固。（每小组制备3～4块胶板）。

D、打孔：待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3.5mm，孔距10～12mm（载玻片分三份，每份中央打孔，见下面示意图）。在同一直线上用打孔器打孔。挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔的边缘。

E 、封底：用微量移液枪于各小孔中加入未加抗体与氨苄青霉素的琼脂少许（5-10μl/），以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。

打孔方案

（2）稀释工作标准参考蛋白：用小离心管将标准参考蛋白用生理盐水稀释成1︰10、1︰16、1︰20、1︰32、1︰40。

稀释工作标准参考蛋白参考

稀释度1︰10 1︰16 1︰20 1︰32 1︰40

参考蛋白(μl)+盐水(μl) 20+180 20+300 20+380 20+620 20+780

（3）加样：用微量加样器将已稀释的五个稀释度的工作标准蛋白以及空白（生理盐水）依次加样，每个加两孔，每孔加入10ul。（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头；加样时毛细滴管尖端不要划破琼脂。同时注意不要产生气泡，以加满为度（但不要溢出）。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。）。

（4）扩散：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，置37℃ 24～28小时。

（5）绘制标准曲线：测量出并记录各份标本的沉淀环直径Φ，并求出每份检样两孔的沉淀环平均直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（mg/ml）为横座标，绘制成标准曲线。

（二）待测血清中IgG水平值的测定：

（１）稀释待测血清：用小离心管将待测血清用生理盐水稀释成1︰2、1︰6、1︰10、1︰20、1︰30、1︰40。

稀释不同浓度待测血清参考

稀释度1︰2 1︰6 1︰10 1︰20 1︰30 1︰40

待测血清(ml)+盐水(ml)0.1+0.1 0.1+0.5 0.1+0.9 0.1+1.9 0.1+2.9 0.1+3.9

（２）加样：用微量加样器分别取稀释的待测血清标本以及空白（生理盐水）加入琼脂胶板各孔中，每孔10μl。

（３）温育扩散：加样完毕，将作好标记的琼脂板平放放入湿盒中，垫湿纱布或海绵以防干燥，湿盒置37°C温箱，24～28小时后观察结果。

（4）结果观察与分析：测量并求出每份检样两孔的沉淀环平均直径Φ，并按照标准曲线计算出待检血清IgG含量。写出较完整的实验报告。未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。

四、实验结果

免疫球蛋白的含量用mg/ml表示，不同批号的参考血清其免疫球蛋白含量不一。

沉淀环的大小与抗原的浓度基本成线性相关。其大小不仅与孔中抗原的浓度相关，而且和琼脂中抗体的浓度有关。相应抗原抗体所形成的沉淀线，如二者浓度相当，沉淀线在孔中央，二者浓度不当时，则沉淀线偏向浓度低的一侧。

工作标准参考蛋白待测血清孔号0 1 2 3 4 5 待测Ⅰ待测ⅡIgG稀释度对照1︰10 1︰16 1︰20 1︰32 1︰40

IgG浓度(µg/ml)

Φ1

Φ2

Φ平均

标准抗原浓度（mg/100ml）标准曲线图

从标准曲线上可查得待检血清相应的IgG含量乘以稀释倍数，即为待见血清中IgG的实际含量。

五、思考题：分析试验结果并探讨试验要点。

六、注意事项

✓琼扩所用的琼脂必须是优质的琼脂粉,若用普通的琼脂条,应事先进行净化精制。

✓制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制。温度太低会导致琼脂凝固，太高将影响所加抗体的活性。

✓制备琼脂板应在水平台上进行,防止产生厚薄不匀。板的厚度要求一致。浇制时防止产生气泡。平皿浇制的琼脂板在4℃冰箱内可保存15天。

✓加滴孔中的抗原和血清时,孔内必须加满而又不能外溢。加样时不能带进小气泡。

✓加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致。

✓在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。

✓不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过高蛋白质变性或未加防腐剂导致细菌污染等所致。

✓加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头。

✓抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多，沉淀带向抗体孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。