基因工程抗体

基因工程抗体研究进展及其临床应用

林晓虹

摘要：基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体．近年来随着生物工程技术的发展，许多基因工程抗体陆续问世，本文详细介绍了基因工程抗体的研究进展，概述了基因工程抗体在临床方面的明显优势和应用潜力．关

键词：抗体；基因工程抗体；噬菌体抗体库

转基因技术迅速发展，其应用和发展的领域日益夸大。但转基因技术的弊端日益凸现，引起众多关注的目光。就转基因技术本身而言，社会各界对它的态度各有异同。不同的国家不同的民族和不同的个体对转基因技术的态度大相径庭。如何看待转基因技术？如何去应用和发展转基因技术？这些都是我们亟待解决的问题

基因工程抗体介绍

基因工程简介

基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的生物药物总称。由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因此，在80 年代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体。

基因工程抗体种类

基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。

1 ．嵌合抗体嵌合抗体（chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。

2 ．人源性抗体是将人抗体的CDR 代之以鼠源性单克隆抗体的CDR ，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。

3 ．完全人源化抗体采用基因敲除术将小鼠Ig 基因敲除，代之以人Ig 基因，然后用Ag 免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。

4 ．单链抗体是将Ig 的H 链和L 链的V 区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链FV （single chain fragment of variable region,sFv ）。SFv 穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。

5 ．双特异性抗体将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL 细胞、NK 细胞、LAK 细胞）表面分子的抗体（CD3 抗体或CD1

6 抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。

1基因工程抗体发展

细胞内抗体

最近，美国FDA强调：目前在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30%。重组抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或与其它分子相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒。重组技术的出现使筛选、人源化、抗体的生产得到革新，并取代杂交瘤技术，从而使以抗体为基础的药剂设计成为可能。

2.制备基因工程抗体的基本技术路线

从宏观上看，目前基因工程抗体主要在酵母、大肠杆菌、动物非淋巴细胞中表达有功能活性的Ig。其生产的技术路线与重组性细胞因子相类似，但由于抗体分子结构复杂，并且具有自己的一些特性。因此，基因工程抗体的操作过程也有自己一些独特的地方。在技术上包括三大环节：①分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立；②构建McAb的基因文库及其表达载体；③转化到非淋巴细胞中进行表达。

(一) 抗体基因的克隆及重组进行基因工程抗体制备的首要任务是获得能表达抗体肽链的基因片段。C区基因的序列比较恒定，可以很容易地获得，关键是准确地获得编码抗体可变区(特别是抗原结合位点区)的基因。目前可能从分泌特异性抗体的杂交瘤株的cDNA文库和基因组文库中进行筛选。正常情况下V区基因不表达，只有经过重排使VJ相连接后的基因才可以表达出具有抗原结合能力的Fv段。因此，人们勿需事先弄清V区的氨基酸排列顺序，只需使用J链基因(该基因的核苷酸序列变异小，可用于共用探针)探针即可从构建的cDNA文库中筛选出含V区基因外显子的基因克隆。遗憾的是，杂交瘤细胞系经常会有一些异常重排的V区基因，其中的部分还可以具有转录活性。因此为获得正确的目的基因，还有必要进一步的鉴定。利用基因组文库的优点在于所获得的V区基因含有完整的转录单位，包括自身的起动子、增强子成分及剪接功能，有助于重组后的顺利高效表达。而利用cDNA文库时(由于不含较长的内含子序列)，可通过PCR技术合成较多的V区基因，较容易获得目的基因。Ig的V基因和C基因均由不同的外显子构成，抗体的每个功能区蛋白均由独自的外显子编码，这给体外加工和重组抗体基因组V和C区的基因带来了便利，可较容易地进行缺失(dalating)、插入(inserting)、交换(exchanging)及改变外显子的次序。

(二) 抗体基因表达载体的构建为了能运载Ig基因，并得以在持续稳定转染的相容细胞中分泌表达，必须构建相应的真核表达载体质粒，这种质粒须具备如下特点：①具备完整的真核转录单位，可以整合到宿主细胞染色体中，并表达或能自行复制其DNA；②因为只有约103～106的真核细胞被转染，因此要从中筛选出被转染的阳性表达细胞，所以该质粒应具备选择性基因标记，其基因产物可在选择性培养基中进行鉴别；③其DNA片段容易被修饰，可进行适宜的插入或剪接；

④内含适宜的限制酶的酶切位点，使适宜的DNA片段容易克隆。根据表达时选用的受体细胞类型，可构建各自相应的载体。为生产出具有功能活性的新型抗体分子，需将编码轻、重链的H和L基因同时导入受体细胞，并使之等量(或接近

等量)地表达和装配。目前采用了两种方法：①分别构建表达H基因和L基因的载体，并用两个载体同时转染受体细胞，该法便于遗传学操作，但只有两种载体同时转染成功并产生等量轻、重链时，才能有效地装配成功能性抗体，因此两种载体应载有不同的抗性基因(多采用neo基因-转染的细胞表现为G418抗性和gpt 基因转染的细胞表现为霉酚酸mycophenolic acid抗性)，并同时使用两种制剂做双重抗性筛选；②将轻、重链基因插入同一载体，该法利于筛选，但插入的基因序列过长，给基因操作带来一定的困难。

(三)抗体基因的表达抗体结构较复杂，与其他单链蛋白或多肽(如细胞因子等)相比，高效表达功能性抗体分子尚有很大困难。目前，许多学者主要是利用哺乳类动物非淋巴细胞，导入用质粒重组的目的基因，表达后，制备基因工程抗体，这是目前制备这类抗体的主要方法。

3.抗体药物发展现状

1.FDA已批准上市的抗体药物。

2.SFDA(中国)已批准上市及临床研究的的抗体药物。

4工程抗体的未来发展与展望

1单克隆抗体的市场需求