生物工程下游技术

5.
基因工程产品，生物安全(biosafety)问题

即要停止菌体扩散。
10
13· 4 生物技术下游加工过程的一般 流程和单元操作
13.4.1 —般工艺流程
1. 2. 3. 4.

培养液(发酵液)预
处理和固液分离
初步纯化(提取)； 高度纯化(精制); 成品加工。 工艺过程决定于产
品的性质和要求达
到的纯度。
生物工艺学
第十三 章
生物工艺下游加工过程概论
1
主要内容

下游加工过程在生物技术中的地位
传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较


生物技术下游加工过程的特点
生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作 生物技术下游加工过程的发展趋向
2
13.1 下游加工过程在生物技术中的地位

下游加工过程：生物化工产品系通过微生物发酵
过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。 从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有 关产品的过程称为下游加工过程(Down stream processing)。

化学工程的单元操作，但生物物质的特性有其特 殊要求
3
下游加工过程在生物技术中的地位

发酵生产中，分离和精制过程所需费用占成本很大部分。


杂质：当进行转移时，杂质不能或较少地随着转移，因而 能达到浓缩和提纯的目的。 二次萃取：有时一次转移并不能将杂质充分除去，例如红 霉素提炼采用二次萃取。
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反应萃取法(Reactive extraction)

溶剂萃取法常遇到困难是分 配系数较低。
一种解决的方法是利用反应 萃取法(Reactive extraction) ， 即利用一种溶剂(通常是有机 磷化合物或脂肪胺)，能按一 定化学计量关系与生物物质 形成特异性的溶剂化键或离 子对化合物。
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The crystals above are of lysozyme, a protein located in the tear ducts of humans and in eggs of other animals.
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13.4.6 成品加工

根据产品应用时的要求，一般经提取和精制后，最后还 需要一些加工步骤。例如浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、 加入稳定剂等。如果最后要求的是结晶性产品，则浓缩、 无菌过滤和去热原等步骤系放在结晶之前，但干燥常常是 最后一道工序。 A 浓缩：升膜或降膜式的薄膜蒸发 B 无菌过滤和去热原：热原是脂多糖类物质，从细菌的细 胞壁产生，注入体内会使体温升高。 C 干燥：真空干燥、红外线干燥、沸腾干燥、气流干燥、 喷雾干燥和冷冻干燥等。
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E 两水相萃取法

两水相萃取法仪适用于蛋白质的提取，双水相对蛋白质和 酶等生物大分子具有保护作用，小分子物质不适应。 由于聚合物分子的不相容性，两种聚合物的水溶液(含盐或 不含盐)可以分成两相。


聚乙二醇PEG与葡聚糖(Dex—tran)的水溶液。 聚合物如PEG和一种盐如磷酸盐。

蛋白质分子可在两相间进行分配。
在发酵过程中，把产物除去，以避免反馈抑制，如利用半透膜的发 酵罐，在发酵罐中加入吸附树脂等 39

结晶可以认为是沉淀的一种特殊情况，结晶的先 决条件是溶液达到过饱和。
达到过饱和方法


加入某些物质，使溶解平衡发生改变，例如调pH；
将溶液冷却或将溶剂蒸发。 正确控制温度、溶剂的加入量和加料速度可以控制晶 体的生长，以有利于结晶的选择性和利用离心机或过 滤器时有利于分离。

应用

低分子量物质的纯化，例如抗生素、柠檬酸。

加入有机溶剂

有机溶剂使溶液的介电常数降低，使水分子的溶解能力降低，在蛋 白质分子周围，不易形成水化层。有机溶剂常引起蛋白质失活。
沉淀能力不强，常同时加入有机溶剂。

调pH至等电点


加入非离子型聚合物：如PEG。 加入聚电解质

如聚丙烯酸，其机理和盐析作用相似。
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沉淀法也用于小分子物质的提取中。
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13· 5 生物技术下游加工过程的发展趋向

膜技术的推广使用

节能、高效

亲和技术的推广使用

分离的选择性大大提高
实验装置球磨机

优质层析介质的研究

色层分离中主要困难之一是层析介质的机械强度差

上游技术对下游过程的影响

生物工程作为一个整体，上、中、下游要互相配合

发酵与提取相结合


细胞碎片的分离

通常用离心分离的方法，但非常困难。

利用两水相萃取法，选择适当的条件，使细胞碎片集中分配在下相。
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超声波细胞破碎仪
15
实验装置球磨机
16
13.4.4 初步纯化(提取)

经固液分离或细胞破碎及碎片分离后，活性物质存在于滤 液中，滤液体积很大，浓度很低，下游加工过程就是浓缩 和纯化的过程，常需好几步操作。


件，使一些蛋白质溶于逆胶束中，而其他蛋白质
则不能。因此和通常的溶剂萃取法相似，可以达
到分离的目的。
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图13-6 蛋白质溶解在逆胶束中的示意图
28
H 超滤法/ultrafilter

超滤法是利用一定截断分子量的超滤膜进行溶质的分离或 浓缩。小于截断值的分子能通过膜，而大于截断值的分子 不能通过膜，因而达到分离。
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13.4.2 发酵液的预处理和固液分离

发酵液预处理的目的在于改变发酵液的性质，以利
于固液分离。

如在活性物质稳定性的范围内，通过酸化、加热、以降低
发酵液的粘度。

加入絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的颗粒。

固液分离方法

传统的板框压滤机和鼓式真空过滤机 离心分离，适用于含固量较多的发酵液。 微滤膜或超滤膜进行错流过滤，液固分离不完全。

适用于超滤的物质，分子量在500—1000000之间，或分子
大小近似地在(1—10nm)之间。

提取小分子，超滤主要用于去除大分子杂质。 提取大分子，超滤主要用于脱盐、浓缩。

超滤的主要缺点是浓差极化和膜的污染，膜的寿命较短，
通量低，难用于处理量大的工业中。
29
30
中空纤维式超滤膜管
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13.4.5 高度纯化
ห้องสมุดไป่ตู้
影响分配系数的因素很多，如聚合物的种类和浓度、聚合物的分子 量，离子的种类，离子强度，pH和温度等，而且这些因素相互有 影响。
对这种复杂系统，尚无理论分析，最适的条件，常需由实验决定。
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已成功地应用在30种酶的提取中。
F 超临界流体萃取/Supercritical Fluid Extraction，SFE

碱性-用酸性离子交换树脂去提取； 酸性-用碱性离子交换树脂提取。例如链霉素是强碱性物质，可用 弱酸性树脂来提取。

选择性吸附、选择洗脱。
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沸石
20
C 沉淀法/precipitation
用于蛋白质的提取。主要起浓缩作用，纯化效果较差。 盐析

高浓度的盐类使蛋白质分子的水化层被除去，而相互吸引。
D 溶剂萃取法/solvent extraction

由于蛋白质遇有机溶剂会引起变性，故溶剂萃取法一般仅 用于抗生素等小分子生物物质的提取。 溶剂萃取法的原理： 抗生素以不同化学状态(游离状态； 成盐状态)存在，在水及与水不互溶的溶剂中溶解度不同。

例如青霉素

在酸性下成游离酸状态，在醋酸丁脂中溶解度较大，因而能从 水转移到醋酸丁酯中； 而在中性下，成盐状，在水中溶解度较大，因而能从醋酸丁酯 转移到水中。
分辨力的精制方法，如色层分离。
5
13· 3 生物技术下游加工过程的特点
1.

培养液(或发酵液)是复杂的多相系统：
含有细胞、代谢产物和未用完的培养基。分散在其中 的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相 近，加上粘度很大，属非牛顿性液体，使从培养液中 分离固体很困难。
2.
培养液中产物浓度很低，杂质含量却很高，特别

经初步纯化后，体积已大大缩小，但纯度提高不多，需要 进一步进行精制。

如沉淀、超滤等也可应用于精制中。 大分子(蛋白斥)和小分子物质的精制方法有类似之处，大 分子物质的精制依赖于色层分离，而小分子物质的精制常 常利用结晶操作。
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A 色层分离

色层分离是一种高效的分离技术。
操作是在柱中进行，包含两个相—固定相和移动

超临界流体：在某一温度与压力时，物质气液两相差别消 失，合并成一相，这时称为临界点，其温度和压力分别称 为临界温度和临界压力。当温度和压力略超过或靠近临界 点时，其性质介于液体和气体之间，称为超临界流体。例 如二氧化碳的临界温度为31.1℃，临界压力为7.3MPa。 超临界流体的密度和液体相近，粘度和气体相近，溶质在 其中的扩散速度可为液体的100倍 变化温度和压力可改变萃取能力，使对某物质具有选择性。 常用二氧化碳作萃取剂，临界压力较低，操作安全，无毒

第一步操作最为重要，称为初步纯化或提取，主要目的在 于浓缩，也有一些纯化作用

后几步操作所处理的体积小，合称为高度纯化或精制。
17
A 吸附法/adsorption

主要用于抗生素等小分子物质的提取。 吸附剂有活性炭、白土、氧化铝、各种离子交换树脂等 缺点

吸附性能不稳定 选择性不高，即有些杂质被一起吸附，然后又一起洗下来； 可逆性差，即常常洗不下来； 不能连续操作，劳动强度较大
相，物质在两相间分配情况不同，在柱中的运动
速度也不同而获得分离。

工业上应用的介质母体有天然、半合成或合成的 高聚物，如纤维素、葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰 胺等。
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色层分离是一组相关技术的总称，根据分配 机理的不同，可以分为如下几种类型
小 很大 大 大 很大
34
35
B 结晶/crystallization



适用于萃取非极性物质 对极性物质萃取能力差，但可加入极性的辅助溶剂称为夹带剂 (entrainer)来补救。
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CO2 Phase Diagram
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G 逆胶束萃取(reversed micelle extraction)

逆胶束可以看作是50—100nm的水溶液微滴依靠表
面活性剂分散在非极性溶剂中。 在逆胶束中，蛋白质处于水溶液的环境中，因而 不会失活 水溶液中含有几种蛋白质时，则可调节系统的条
是利用基因工程方法产生的蛋白质常常伴有大量 性质相近的杂质蛋白质。
6

从低浓度的混合物中分离纯组分，需要较大的能量。例如 在恒温、恒压下，将理想溶液分离为纯物质的最小能量

W = -RT∑xilnxi


Xi——组分i的摩尔分数；
T——热力学温度； R——气体常数 W——1摩尔理想溶液分离为纯物质所需的最小能量

式13-1可见所需能量粗略地和浓度的负对数成比例；据统
计，产品的售价大致和浓度的负对数成比例见图13-1。
7
8
9
3.
各批发酵液成分不尽相同

发酵或培养都是分批操作、生物变异性大。发酵液的 放罐时间、发酵过程中消沫剂的加入都对提取有影响。
4.
发酵废液量很大，BOD值较高

经生物处理后才能排放。

传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)， 占整个工厂投资费用 的60%

重组DNA发酵、精制蛋白质：80%-90%

英国政府工业部，于1983年发起生物分离计划(BIOSEP)， 专门研究下游加工过程，专门国际会议；

我国也于1989年工2月在济南召开了一次专门会议。
4
13.2 传统生化产品和基因工程产品回收 方法的比较
12
板框压滤机
鼓式真空过滤机
BiomaxTM高流速超滤 膜
13
13.4.3 细胞破碎和其碎片的分离

细胞破碎的方法有机械、生物、化学等方法

大规模生产

高压匀浆器(High pressure homogenizer)：利用液相剪切力和与固定
表面撞击所产生的应力；

球磨机(Ball mill)：依靠研磨。 超声波

只有对新抗生素提取或其它方法都不适用时，才考虑用吸
附法。
18
B 离子交换法/ion exchange

离子交换法也主要用于小分子的提取。离子交换法系利用 离子交换树脂和生物物质之间的化学亲和力，有选择性地 将生物物质吸上去，然后以较少量的洗脱剂将它洗下来；

生物物质须是极性化合物，在溶液中能形成离子

传统生化产品都为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度 要求不高，提取方法较简单)，其理化性能，如平衡关系 等数据都为已知，因此放大比较有根据；相反基因工程
产品都是大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。

基因工程产品大多处于细胞内，提取前需破碎细胞，增 加了很多困难。

基因工程产品发酵液中，浓度较稀，杂质较多，大分子 较小分子不稳定(如对剪切力)，故提取困难，常需利用高