第16章 Southern杂交技术

第16章 Southern杂交技术

根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA 进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。

核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。其基本过程包括以下几步。首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleic acid blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。

根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术（Dot blot）、Southern杂交技术（Southern blot）、Northern杂交技术（Northern blot）。前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。本章主要介绍Southern杂交技术及其与斑点杂交技术的不同点。而Northern杂交技术将在第17章介绍。

16.1主要内容

1. Southern Blot方法的原理。

2. DNA琼脂糖凝胶电泳。

3. DNA转移至硝酸纤维素膜及膜处理。

4. 介绍随机引物法标记DNA探针，Southern blot的预杂交、杂交及显色过程。

16.2目的要求

掌握Southern blot方法的原理；掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA至硝酸纤维素膜及膜处理。

16.3 实验原理

Southern杂交技术是由Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交技术，并因此而得名。其原理是根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测这些被转移的DNA片段。

主要步骤包括将基因组DNA进行限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳分离，经碱变性等预处理之后，平铺在已用电泳缓冲液饱和了的两张滤纸上，在凝胶上部覆盖一张硝酸纤维素滤膜，接着加一叠干滤纸，然后再压盖一重物。由于干滤纸的吸引作用，凝胶中的单链DNA便随电泳缓冲液一起转移。这些DNA分子一旦与硝酸纤维素滤膜接触，便会牢牢地与之结合，而且是严格按照它们在凝胶中的谱带模式，原样地被吸印到滤膜上。在80℃下烘烤1 2h，DNA片段就会被稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。然后将此滤膜移放在加有标记探针的溶液中进行核酸杂交，漂洗去游离的没有杂交上的探针分子，用适当的方式显色，与溴化乙锭染色的凝胶谱带作对照比较，便可鉴定出与探针具有同源性的限制片段的大小和位置。见图16-1。

图 16-1. Southern blot印迹杂交原理示意图

（a）核酸内切酶消化的基因组 DNA；（b）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段；

（c）凝胶中的DNA谱带转移到硝酸纤维素滤膜上；（d）滤膜与标记的DNA分子探针杂交；（e）显色显示杂交的DNA谱带。

Southern blot方法十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ng DNA也能被清晰地检测出来。

16.4材料、试剂及器材

16.4.1 材料及试剂

1．待检基因组DNA样品由实验室提供。本实验所用特异性探针可预先标记，标记方法见第6章。琼脂糖凝胶电泳试剂，参见第7章。DIG标记和检测试剂盒，各种限制性内切酶等。

2．20×SSC溶液：氯化钠 3mol/L，柠檬酸三钠0.3mol/L（pH7.0）。称取NaCl 175.3g，柠檬酸三钠·2H20 88.2g，溶于800ml蒸馏水中，用1mol/L HCl调pH7.0，最后定容到1000ml。

3．变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl。

4．中和液：1mol/L Tris-HCl（pH7.4），1.5mol/L NaCl。

5．洗涤液Ａ: 2×SSC，0.1%SDS。

洗涤液Ｂ：0.1×SSC，0.1%SDS。

洗涤液 C: 0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl(pH7.5），3％(v/v) Tween-20。

6．马来酸溶液(Maleic acid): 0.1mol/L 马来酸，0.15mol/L NaCl，用固体NaOH调pH7.5。

7．平衡液(Detection buffer): 0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl(pH9.5）。

8．终止液(TE buffer): 10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。

9．封阻（Blocking）溶液: 用马来酸溶液将10×Blocking solution 稀释10倍。

10．抗体溶液（Antibody solution）:用Blocking溶液将Anti-Digoxigenin-AP按照1：5000比例稀释。

11．显色液（Color-substrate solution）: 平衡液中含2％NBT/BCIP储存液。

16.4.2 器材

硝酸纤维素滤膜；恒温水浴，塑料带，剪刀，平头镊子，封口机，烤箱，台式高速离心机，