第16章 Southern杂交技术
第16章 Southern杂交技术
第16章 Southern杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。
将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA 进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。
它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。
还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。
核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。
其基本过程包括以下几步。
首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleic acid blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。
根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术（Dot blot）、Southern杂交技术（Southern blot）、Northern杂交技术（Northern blot）。
前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。
本章主要介绍Southern杂交技术及其与斑点杂交技术的不同点。
而Northern杂交技术将在第17章介绍。
16.1主要内容1. Southern Blot方法的原理。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳。
Southern 杂交技术-1
Southern 杂交技术-1Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。
它可用于基因组特定D NA序列的定位，可以测定相关片段的同源性、可以从c库、基因组文库中筛选完整基因等。
用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。
该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。
下面分别介绍利用光敏生物素试剂盒及DIG试剂盒进行杂交的方法。
十五－1:光敏生物素试剂盒杂交实验一仪器：分子杂交仪、摇床、烤箱、取液器、电泳仪、电泳槽二试剂：硫酸葡聚糖钠盐(可不用)、聚乙烯吡赂啉酮（PVP）、聚蔗糖、牛血清白蛋白（BSA）、100mM EDTA、3MnaAC、无水乙醇、电泳缓冲液、切变性鲱鱼精DNA （100ug/ml）20×SSC溶液氯化钠３Ｍ预杂交液６×SSC柠檬酸三钠 0.3M （含100ug/ul变性鲱鱼精DNA）pH 7.0 ５×Denhardt's 溶液0.5%SDS变性液 0.5M NaOH 中和液 1M Tris-HCL pH 7.41.5M NaCL 1.5M NaCL封闭液 3gBSA溶于70ml水中，浓盐酸调pH至3.0,煮沸20分钟后，冷至室温，NaOH调pH至7.5,加入10ml以下缓冲液（1M Tris-HCL pH7.5, MgCL2 0.19%, NaCL 5.8%, T riton X-100 0.05ml）定容至100ml５０×Denhardt's 溶液 1％PVP 1M PBS NaCL 0.8% pH 7.41%BSA KCL 0.02%1%聚蔗糖 Na2HPO4 0.144%KH2PO4 0.024%洗涤液Ａ:２×SSC,250ml中含0.1%SDSＢ：0.1×SSC,250ml中含0.1%SDS Ｃ：Tris-HCL 100mM pH 7.5 Ｄ：Tris-HCL 100mMNaCL 1M NaCL 0.5MMgCL2 2mM Tween 20 0.5% pH 7.5Triton X-100 0.05%亲和素－碱性磷酸酶溶液 Tris-HCL 100mMNaCL 1MMgCL2 2mMTriton X-100 0.05%pH 7.5碱性磷酸酶2-3单位/ml底物溶液 Tris-HCL 100mM pH 9.5 终止液NaCL 100mM Tris-HCL 10mMMgCL2 5mM EDTA 1mM。
southern杂交原理
southern杂交原理Southern杂交原理是一种分子生物学技术，常用于研究DNA序列。
它是由爱德华·南方（Edwin Southern）于1975年提出的，被广泛应用于DNA杂交等领域。
Southern杂交原理主要是通过将DNA样品与DNA探针杂交，然后用放射性同位素或化学荧光等方法检测杂交的情况，从而确定目标DNA序列的存在与否。
这一原理的核心是通过互补配对的碱基间形成稳定的双链结构，从而实现DNA的特异性识别与检测。
在Southern杂交实验中，首先需要提取待检测的DNA样品。
这可以通过细胞裂解、DNA纯化等方法来完成。
然后，将目标DNA序列与DNA探针进行杂交反应。
DNA探针是一段已知序列的DNA 片段，通常是标记有放射性同位素或荧光染料的单链DNA。
在杂交反应中，目标DNA序列与DNA探针通过互补配对的碱基结合在一起形成双链结构。
通过探针的标记物可以追踪杂交的情况。
放射性同位素通常用于探测杂交产物，而化学荧光则常用于非放射性检测。
完成杂交反应后，需要进行杂交产物的检测与分析。
对于放射性同位素标记的探针，可以通过放射性测量仪来检测杂交产物的放射性信号强度。
而对于化学荧光标记的探针，可以通过荧光显微镜或荧光成像仪来观察和记录荧光信号。
Southern杂交原理的应用非常广泛。
例如，它可以用于检测特定基因的存在与表达情况，研究基因组结构与功能，鉴定DNA的来源，进行亲缘关系分析等。
此外，Southern杂交还可以与其他分子生物学技术相结合，如聚合酶链反应（PCR），构建DNA文库等，进一步拓展其应用范围。
Southern杂交原理是一种重要的分子生物学技术，通过DNA的互补配对和标记物的检测，实现了对目标DNA序列的高度特异性识别与检测。
它在基础研究、临床诊断、法医学等领域具有广泛的应用前景，为科学研究和医学诊断提供了有力的工具和方法。
sourthern杂交的原理
sourthern杂交的原理你知道 Southern 杂交不？这可是个在分子生物学领域里相当厉害的技术呢！咱先来说说啥是 Southern 杂交。
简单来讲，它就像是一个“侦探”，专门用来寻找特定的 DNA 片段。
想象一下，我们的细胞里有好多好多的 DNA，就像一个超级大的图书馆，里面的书多到数不清。
而我们想要找到某一本特定的“书”，也就是特定的 DNA 片段，这时候 Southern 杂交就派上用场啦！那它到底是咋工作的呢？其实啊，原理也不难理解。
第一步呢，我们得把细胞里的 DNA 提取出来。
这就好比是把图书馆里的书都搬出来放在一起。
但是这些 DNA 都是长长的链条，我们得把它们“剪碎”，这就是用限制性内切酶来切割 DNA 啦。
切成一段一段的，就像把长长的书剪成了好多小篇章。
接下来，我们要让这些 DNA 片段“跑个步”，这就是电泳啦！把它们放在电场里，根据大小不同，它们会跑得快慢不一样，这样就分开啦。
就像是一群人跑步，个子小的跑得快，个子大的跑得慢，最后就分开站成一排了。
然后呢，我们要把这些分开的 DNA 片段从凝胶里转移到一个膜上。
这膜就像是一个新的“书架”，让 DNA 片段都能稳稳地待在上面。
这个过程就像是把书从一个地方搬到另一个地方放好。
当探针和它要找的 DNA 片段结合上之后，我们就能通过检测这些标记，来发现我们想要的那个 DNA 片段啦！是不是很神奇？就好像是钥匙找到了对应的锁，然后我们就知道哪把锁是我们要的啦！你看，Southern 杂交就像是一场精心设计的“寻宝游戏”。
我们通过一系列的操作，最终找到了我们想要的那个珍贵的“宝藏”——特定的 DNA 片段。
这个技术在好多研究里都特别有用呢！比如说，我们想看看某个基因在不同的组织或者细胞里有没有，或者想研究一些遗传病是不是和特定的 DNA 变化有关，Southern 杂交都能帮上大忙！怎么样，是不是觉得 Southern 杂交挺有趣的？虽然过程听起来有点复杂，但是只要一步步来，就像解谜一样，最终总能找到答案！下次再碰到和它相关的问题，相信你也能明白个大概啦！。
Southern杂交方法
分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。
膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。
再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。
最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。
由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。
Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。
（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。
四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。
然后将凝胶置于一搪瓷盆中。
（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。
留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。
southern杂交
Southern杂交概述Southern杂交是一种常用于分析DNA序列和判定基因组结构的实验技术。
该技术由英国分子生物学家爱德华·南方于1975年首次提出，并以他的名字命名。
Southern杂交操作简单，适用于各种生物材料，被广泛应用于基因组学和分子生物学研究领域。
原理Southern杂交的原理基于亲和性结合和DNA互补碱基配对的特性。
该技术通过将待检测的DNA样品与一段标记的DNA探针进行杂交，通过探针与待检测样品DNA的配对形成稳定的双链DNA形式。
随后，通过探针上的标记进行检测，从而确定目标DNA序列的存在与否。
步骤Southern杂交主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从样本中提取待检测的DNA。
2.DNA消解：将DNA样本通过限制性内切酶消解为较小的DNA片段。
3.凝胶电泳：将消解后的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据DNA片段的大小形成DNA条带。
4.DNA定位：将凝胶中的DNA片段转移到薄膜或膜纸上。
5.杂交处理：将转移到膜上的DNA片段与一段标记的DNA探针进行杂交，探针可以是放射性同位素标记的DNA或荧光标记的DNA等。
6.杂交条件优化：调整温度、盐浓度和杂交时间等条件，以提高杂交效率和特异性。
7.杂交探测：通过探针上的标记进行检测，如放射性同位素检测或荧光检测。
8.数据分析：根据杂交的结果，确定目标DNA序列的存在与否。
应用Southern杂交技术在许多生物学研究中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：1.基因型分析：可以通过Southern杂交技术确定目标基因的存在、拷贝数和序列变异等信息。
2.基因组结构研究：可以通过Southern杂交技术确定目标基因组的结构和大小。
3.DNA重组检测：可以通过Southern杂交技术检测DNA重组事件的发生和定位。
4.DNA甲基化分析：可以通过Southern杂交技术研究DNA甲基化修饰的分布和变化。
5.遗传疾病诊断：可以通过Southern杂交技术检测遗传疾病相关基因的缺失、重复或突变等。
southern杂交技术
Sourthern杂交技术摘要：使用sourthern杂交技术来检测转基因植物中插入的外源基因的拷贝数。
以含有外源基因的水稻转基因植株叶片为材料，CTAB法少量抽提总DNA，总DNA经限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳、转移尼龙膜上，最后与地高辛标记的探针进行杂交。
通过条带的有无来判断是否为含有外源基因的转基因植物，条带的多少反映了转基因植株中外源基因的拷贝数。
结果：关键词：抽提酶切转膜探针杂交Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。
但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。
1材料与方法1.1材料及试剂水稻转基因植株叶片、限制性内切酶HindⅢ、尼龙膜、地高辛标记系统试剂盒等。
1.2水稻总DNA的少量抽提CTAB法抽提DNA步骤：(1)采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉；(2)取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管，加入1ml预热至95ºC以上的1.5⨯CTAB，混匀；(3)65ºC水浴中放置30分钟以上，每隔5分钟上下颠倒混合数次(DNase变性，促进内溶物释放)；(4)12000g离心2分钟；(5)吸取600μl上清于新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色；(6)12000g离心5-10分钟；(7)吸取450μl上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95％乙醇和1/10体积3M NaAc，轻轻的上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现；(8)12000g离心10分钟；(9)弃去上清，用500μl 75％乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，12000g离心5分钟，弃上清,自然干燥；(10)加入50μlTE（含20μg/ml RNaseA），放于4ºC溶解；(11)充分溶解后，测定并调整浓度。
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术 ppt
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术摘要：上世纪70年代美籍华裔科学家简悦威采用Southern印迹杂交技术成功诊断了α地中海贫血症和镰状细胞贫血症，开创了临床分子生物学检验的先河，他是怎样做到的呢？知识点：分子杂交、核酸分子杂交、探针Southern印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳技术、印迹技术临床分子生物学检验技术的发展第一阶段：分子杂交第二阶段：PCR第三阶段：生物芯片第四阶段：DNA测序美籍华裔科学家简悦威应用DNA分子杂交技术诊断α地中海贫血(1976)、镰状细胞贫血(1978)分子杂交(molecular hybridization) 两条单链核酸、抗原与抗体、受体与配体等经相互作用重新组成新的杂交分子图片源于网络非原创核酸分子杂交两条序列互补的单链核酸之间(DNA 与DNA ，DNA与RNA或RNA与RNA)借助氢键相连形成杂合双链碱基互补配对A=T,A=U,C≡G杂合双链图片源于网络非原创核酸分子杂交：待测核酸与探针图片源于网络非原创核酸探针 (nucleic acid probe)能与待测靶核酸特异互补杂交的已知被标记的核酸分子核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P、3H、35S等2.非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素等分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交Southern印迹杂交(E.M.Southern,1975) ——镰状细胞贫血症的分子诊断(1978)琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创琼脂糖凝胶电泳技术——分离、纯化、鉴定核酸 碱性缓冲液 琼脂糖凝胶 负极 正极核酸加样孔 电极琼脂糖凝胶电泳技术可将分子量和构象不同的核酸分子进行分离小分子量核酸电泳结束后不同分子量的核酸的迁移位置琼脂糖凝胶电泳技术图谱DNA Marker 核酸样品琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术印迹技术 (Blotting）将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上印迹技术膜核酸凝胶琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创应用Southern印迹检测红色特异DNA片段1. 从样品中提取DNA并通过限制性核酸内切酶消化样品DNA2.消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离3. 凝胶中DNA经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交6. 通过洗涤除去未杂交的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段Southern 印迹技术1. 通过限制性核酸内切酶消化样品DNA，2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，3. 凝胶上被分离好的DNA片段经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交，6. 杂交后洗脱未特异结合的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA 片段杂交检测杂交信号预杂交制备携带标记的核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针图片源于网络非原创应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血？分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术。
Southern印迹杂交
Southern印迹杂交Southern印迹杂交实验原理核酸分⼦杂交技术是分⼦⽣物学领域中最常⽤的具体⽅法之⼀。
其基本原理是：具有⼀定同源性的两条核酸单链在⼀定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是⾼度特异的。
由于核酸分⼦的⾼度特异性及检测⽅法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分⼦的限制图谱。
但为了进⼀步构建出DNA分⼦的遗传图，或进⾏⽬的基因序列的测定以满⾜基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分⼦中基因编码区的⼤⼩和位置。
有关这类数据资料可应⽤Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：⼀是将待测定核酸分⼦通过⼀定的⽅法转移并结合到⼀定的固相⽀持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;⼆是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在⼀定的温度和离⼦强度下退⽕，即分⼦杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡⼤学的E.M.Southern⾸创的，Southern印迹杂交故因此⽽得名。
早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经⽑细管的虹吸作⽤，转移到硝酸纤维膜上。
近年来印迹⽅法和固定⽀持滤膜都有了很⼤的改进，印迹⽅法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如AP T、ABM纤维素膜）等。
利⽤Southern印迹法可进⾏克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某⼀基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性⽚断长度多态性分析（RFLP）等。
实验⽅法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。
⼀、待测核酸样品的制备（⼀）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。
1. 采⽤适当的化学试剂裂解细胞，或者⽤组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. ⽤蛋⽩酶和RNA酶消化⼤部分蛋⽩质和RNA；3. ⽤有机试剂（酚/氯仿）抽提⽅法去除蛋⽩质。
（⼆）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成⼤⼩不同的⽚段之后才能⽤于杂交分析，通常⽤限制酶消化DNA。
southern杂交和northern杂交的原理和应用
Southern杂交和Northern杂交是两种常用的分子生物学技术，它们主要通过探针与DNA序列互相配对来检测目标DNA片段是否存在，并确定其大小和数量。
Southern杂交：Southern杂交是一种检测DNA序列的技术，它利用DNA探针与杂交物中的目标DNA 特异性结合，来检测目标DNA序列的存在和数量。
这种方法一般应用于DNA分子量较大的靶标（如基因、整个染色体等）的检测，可以用于鉴定基因的剪接等多种分子生物学研究。
Southern杂交的原理是将DNA样本在电泳板上进行电泳分离，然后用互补的DNA探针杂交分离出目标DNA，在膜或凝胶上通过探针与目标DNA结合来检测。
Northern杂交：Northern杂交是一种检测RNA序列的技术，它利用RNA探针与杂交物中的目标RNA 特异性结合，来检测目标RNA序列的存在和数量。
这种方法一般应用于研究基因表达调控、细胞信号转导和病理生理等方面。
Northern杂交的原理与Southern杂交类似，也是先将RNA 样本在凝胶上进行电泳分离，然后用互补的RNA探针进行杂交分离出目标RNA，在膜或凝胶上通过探针与目标RNA结合来检测。
Southern杂交和Northern杂交的应用：Southern杂交和Northern杂交技术广泛应用于分子生物学、遗传学及生命科学领域。
它们可以用于：1. 检测基因的表达和剪接变异等2. 研究基因家族和功能3. 鉴定细胞中的某一DNA或RNA序列的存在4. 研究基因转录和翻译的调控机制5. 检测突变或重组基因的存在6. 进行基因诊断和疾病基因筛查等除了上述的应用外，Southern杂交和Northern杂交技术还可以广泛应用于以下领域：1. 植物和动物遗传图谱的构建：能够通过探针与DNA或RNA序列的配对来研究基因表达、调控和功能等信息，对于植物和动物的遗传图谱构建有重要的意义。
2. 生物安全监测：利用Southern杂交和Northern杂交技术可以检测到转基因食品或者是非法贩卖的野生动物制品等违法行为，具有重要的生物安全监测作用。
southern杂交主要流程
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southern印记杂交
实验步骤
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III） 电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链） 转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上， 紫外交联固定） 预杂交（减少标记探针的非特异性结合， 小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂） 杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以 碱基互补的原则进行杂交） 洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针） 检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
体积越小,杂交动力学越高;
DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃;
温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用) 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
Southern杂交技术原理
Southern杂交技术是由Edward M. Southern在 1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交 技术，并因此而得名 根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的 DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过 与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测 这些被转移的DNA片段。
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实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样 1.基因组DNA10 mg 2.酶切样品（1） 3.酶切样品（2） 4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml) 5.酶切样品（1） 6.酶切样品（2） 7.基因组DNA10 mg
Southern印迹杂交
Southern印迹杂交实验原理核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。
有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。
近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。
利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。
实验方法本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。
一、待测核酸样品的制备（一）制备待测DNA基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。
1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3. 用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。
（二）DNA限制酶消化基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。
Southern杂交技术在农作物遗传转化研究中的应用
2、DNA digestion：将基因组DNA进行限制性内切酶消化，得到特定长度的 DNA片段。
3、凝胶电泳：将消化后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳分离，将不同大小的 DNA片段分离出来。
4、Southern转移：将凝胶中的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上，以便进行进 一步的杂交操作。
5、探针标记：将特异性探针进行放射性标记，以便在杂交过程中进行信号 的放大和检测。
参考内容二
一、引言
Southern印迹杂交是一种常用的分子生物学技术，用于分析特定DNA序列在 基因组中的存在和分布。这项技术的改良版本，既保留了原始方法的准确性，又 极大地提高了效率和易用性，对于各类科研和临床应用具有重要的实际价值。
二、方法描述
在改良的Southern印迹杂交方法中，我们采用了更高效的DNA提取和纯化步 骤，以及创新的凝胶电泳和转移步骤。这使得我们能更好地保留和检测到DNA的 特异性序列。
三、详细介绍
1、印迹剂的选择
在Southern印迹杂交过程中，需要选择合适的印迹剂。常用的印迹剂包括尼 龙膜、滤纸、PVDF膜等。选择合适的印迹剂非常重要，因为它直接影响到DNA的 转移效果和杂交效率。
2、杂交条件的设定
杂交条件的设定对于Southern印迹杂交技术的结果至关重要。这些条件包括 杂交温度、盐浓度、缓冲液类型等。这些参数需要根据实验目的和具体实验条件 进行调整，以获得最佳的杂交效果。
6、杂交反应：将标记好的探针与硝酸纤维素膜上的DNA片段进行杂交反应， 使得特异性序列能够结合在一起。
7、洗膜和显影：洗去未结合的探针，并通过放射性自显影技术显现出杂交 信号，从而确定目标基因的位置和拷贝数。
参考内容
基本内容
Southern印迹杂交技术是一种在基因组学和分子生物学中广泛应用的印迹技 术，主要用于检测和识别特定DNA序列。本次演示将详细介绍Southern印迹杂交 技术的原理、实现过程、优点、不足以及其他相关印迹技术，最后对Southern印 迹杂交技术的优劣和应用前景进行全面评价。
Southern杂交技术
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类：
②固相杂交：将参加反应的一条核酸链先 固定在固体支持物上，另一条游离在溶 液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、 尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。 固相杂交时，未杂交的游离片段可容易 地漂洗除去，膜上的杂交物容易检测和 能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最 为常用。
8、杂交结果的检测
② 非放射性核素探针的检测
显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质（如酶、荧光 素等）进行杂交信号的检测。常用的检测物质与方法有以下几类：
– 酶法检测：这是最常用的检测方法。通过酶促反应使其底物形成有 色反应产物。最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
– 荧光检测法：荧光检测法主要用于非放射性探针的原位杂交检测。 – 化学发光法：化学发光是指在化学反应过程中伴随的发光反应。 – 电子密度标记：利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下进行检
二、Southern杂交的基本原理
• 利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切 、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定 量分析、基因突变分析及限制性片断长度多 态性分析（RFLP）等。
三、Southern 杂交的主要步骤
1、待测DNA样品的制备、酶切 2、待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
⑥探针标记 –随机引物法 –缺口平移法 (DNaseI and DNA聚合酶I) –末端标记法 • 碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶 [γ-32p]-ATP标记 DNA/RNA-5′ • 末端转移酶（poly(N*)n） • T4DNA聚合酶/Klenow片断 （粘末端补平）
同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连 续8个或更多的碱基同源。
southern杂交原理的应用
Southern杂交原理的应用1. Southern杂交的基本原理Southern杂交是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定DNA序列在给定样本中的存在与表达情况。
它基于DNA的互补配对原理，通过将待测DNA与已知DNA序列进行杂交反应，然后通过检测反应产物来确定目标DNA是否存在。
Southern杂交实验通常包括以下步骤：1.DNA提取：从待测样品中提取DNA，并经过酶切等处理，将复杂的DNA样品变成易于分析的特定DNA片段。
2.DNA电泳：将DNA样品根据大小分子量在琼脂糖凝胶中进行电泳分离，以得到待测DNA片段。
3.DNA转移：将电泳分离后的DNA片段转移到膜上，通常是通过电泳转移（electroblotting）或吸附转移（capillary blotting）的方式。
4.杂交：将已知DNA序列与待测DNA膜进行杂交反应，其中已知DNA序列可能是标记过的探针（probe）或同源基因组DNA。
5.检测：通过封闭法（i.e., 冷光法或放射性法）或非封闭法（i.e., 荧光原位杂交法）来检测杂交反应产物，从而确定目标DNA是否存在。
2. Southern杂交的应用Southern杂交技术在分子生物学和基因组学的研究中有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：2.1 基因组DNA定量Southern杂交可用于检测和定量目标基因组DNA的存在。
通过使用特定探针，可以确定基因组中的某个DNA序列是否存在，并通过探针的信号强度来评估该序列在基因组中的数量。
2.2 基因突变分析Southern杂交可用于检测基因组DNA中的突变。
通过与野生型DNA进行杂交，可以检测突变DNA片段的变化，从而识别基因突变。
2.3 基因拷贝数分析Southern杂交可用于检测基因拷贝数的变异。
通过与标准DNA进行比较，可以确定目标DNA的拷贝数，并评估在不同个体或物种之间的差异。
2.4 基因组同源性分析Southern杂交可用于研究不同物种或个体之间的基因组同源性。
Southern 杂交
Southern 杂交Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern杂交。
但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。
一、基因组DNA的制备（前述）(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费送)二、基因组DNA的限制酶切(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)根据实验目的决定酶切DNA的量。
(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。
购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该的产品目录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。
消化的DNA 浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。
由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入DNA（1μg /μl）20 μg10×酶切buffer 4.0 μl限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl加ddH2O 至500 μl在最适温度下消化1-3hr。
消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。
Southern印迹杂交作业指导书
Southern印迹杂交作业指导书实验目的学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。
实验原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异性的。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
这种技术是E．M．Southern l975年首创的，因此称Southern印迹杂交。
Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。
这里主要介绍目前常用的电转法。
电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。
一般只需2～3h，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。
常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。
实验内容材料和试剂印迹试剂l．待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。
2．变性液 1.5mol／L NaCl，0.5mol／LNaOH，高压灭菌。
3．中和液1mol／L Tris·HC1(pH8.0)，1.5mol／L NaCl，高压灭菌。
4．电泳液和转移液1×TBE或TAE。
5．尼龙膜、铂金丝电极电转仪。
杂交试剂1．预杂交液5×Denhardt试液，50mmol／L磷酸缓冲液(pH7.0)，0．2％SDS，500μg／m1变性的鲑精DNA片断，50％甲酰胺(也可不用)。
2．20×SSC，3mol／L NaCl 0.3mol／L柠檬酸钠。
3．2×SSC，0.1％SDS 溶液。
4．0.1×SSC，0.1％SDS溶液。
5．0.1×SSC溶液。
Southern杂交
Southern 杂交（一）目的通过分子杂交，检测重组DNA分子中插入的外源基因是否确是原供体中的某一基因片段。
（二）原理Southern 印迹杂交是指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维膜），再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA的片段的一种技术。
Southern 杂交的实验流程如下：基因组DNA样品的限制性酶切-> 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳-> DNA的变性、转膜与固定-> 杂交与杂交后清洗-> 杂交结果的检测（三）材料1.基因组DNA样品的限制性酶切：1）样品：GFP蛋白基因2）试剂：限制性内切酶；10x酶切缓冲液；0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚；氯仿/乙醇=24：1（体积比）；预冷无水乙醇和70%乙醇；TE缓冲液3）仪器及器材：恒温水浴锅；电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪2.酶切样品的琼脂糖凝胶电泳：1）样品：上一个实验的酶切产物2）试剂：琼脂糖；1xTAE缓冲液；6xDNA加样缓冲液；EB溶液；DNA分子量标准（DNA Marker）3）仪器及器材：电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪；凝胶成像分析系统；微量移液器3.DNA的变性、转膜与固定：1）样品：电泳后的琼脂糖凝胶2）试剂：水解液（0.25mol/L HCL）；变性液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L NaOH, 0.2mol/L HCL）；中和液（1mol/L Tris-HCL pH=7.4, 1.5mol/L NaCl）；硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜；碱性转移缓冲液（0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCl）；20xSSC（3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸三钠pH=7.0）；20xSSPE（3.6mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4, 0.02mol/L EDTA pH=7.7）；50xDenhardt 试剂（5g聚蔗糖Ficoll 400, 5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白，加入无菌蒸馏水至500ml）3）仪器及器材：印迹转膜装置（托盘、支持物、Whatman 3MM滤纸、纸巾、玻璃板、重物等），紫外交联仪4.杂交与杂交后清洗：1）样品：固定了DNA酶切样品的硝酸纤维膜2）试剂：预杂交液（6xSSC, 5xDenhardt试剂, 0.5% m/V SDS, 1μg/ml polyA, 100μg/ml 鲑鱼精DNA, 50% V/V 甲酰胺）3）仪器及器材：杂交管（瓶），杂交炉5.杂交结果的检测：1）样品：杂交后已清洗的NC膜2）试剂：显影液，定影液3）仪器及器材：X线胶片，X线胶片盒（带增感屏），保鲜膜（四）步骤基因组DNA样品的限制性酶切：1）酶切：在1.5ml离心管中依次加入ddH2O Xμl；1μg/μl DNA 20μg；10x酶切缓冲液4.0μl；10U/μl限制性内切酶5.0μl，总体积500μl。
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第16章 Southern杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。
将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA 进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。
它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。
还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。
核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。
其基本过程包括以下几步。
首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleic acid blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。
根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术（Dot blot）、Southern杂交技术（Southern blot）、Northern杂交技术（Northern blot）。
前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。
本章主要介绍Southern杂交技术及其与斑点杂交技术的不同点。
而Northern杂交技术将在第17章介绍。
16.1主要内容1. Southern Blot方法的原理。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳。
3. DNA转移至硝酸纤维素膜及膜处理。
4. 介绍随机引物法标记DNA探针，Southern blot的预杂交、杂交及显色过程。
16.2目的要求掌握Southern blot方法的原理；掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA至硝酸纤维素膜及膜处理。
16.3 实验原理Southern杂交技术是由Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交技术，并因此而得名。
其原理是根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测这些被转移的DNA片段。
主要步骤包括将基因组DNA进行限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳分离，经碱变性等预处理之后，平铺在已用电泳缓冲液饱和了的两张滤纸上，在凝胶上部覆盖一张硝酸纤维素滤膜，接着加一叠干滤纸，然后再压盖一重物。
由于干滤纸的吸引作用，凝胶中的单链DNA便随电泳缓冲液一起转移。
这些DNA分子一旦与硝酸纤维素滤膜接触，便会牢牢地与之结合，而且是严格按照它们在凝胶中的谱带模式，原样地被吸印到滤膜上。
在80℃下烘烤1 2h，DNA片段就会被稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。
然后将此滤膜移放在加有标记探针的溶液中进行核酸杂交，漂洗去游离的没有杂交上的探针分子，用适当的方式显色，与溴化乙锭染色的凝胶谱带作对照比较，便可鉴定出与探针具有同源性的限制片段的大小和位置。
见图16-1。
图 16-1. Southern blot印迹杂交原理示意图（a）核酸内切酶消化的基因组 DNA；（b）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段；（c）凝胶中的DNA谱带转移到硝酸纤维素滤膜上；（d）滤膜与标记的DNA分子探针杂交；（e）显色显示杂交的DNA谱带。
Southern blot方法十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ng DNA也能被清晰地检测出来。
16.4材料、试剂及器材16.4.1 材料及试剂1．待检基因组DNA样品由实验室提供。
本实验所用特异性探针可预先标记，标记方法见第6章。
琼脂糖凝胶电泳试剂，参见第7章。
DIG标记和检测试剂盒，各种限制性内切酶等。
2．20×SSC溶液：氯化钠 3mol/L，柠檬酸三钠0.3mol/L（pH7.0）。
称取NaCl 175.3g，柠檬酸三钠·2H20 88.2g，溶于800ml蒸馏水中，用1mol/L HCl调pH7.0，最后定容到1000ml。
3．变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl。
4．中和液：1mol/L Tris-HCl（pH7.4），1.5mol/L NaCl。
5．洗涤液Ａ: 2×SSC，0.1%SDS。
洗涤液Ｂ：0.1×SSC，0.1%SDS。
洗涤液 C: 0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl(pH7.5），3％(v/v) Tween-20。
6．马来酸溶液(Maleic acid): 0.1mol/L 马来酸，0.15mol/L NaCl，用固体NaOH调pH7.5。
7．平衡液(Detection buffer): 0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl(pH9.5）。
8．终止液(TE buffer): 10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。
9．封阻（Blocking）溶液: 用马来酸溶液将10×Blocking solution 稀释10倍。
10．抗体溶液（Antibody solution）:用Blocking溶液将Anti-Digoxigenin-AP按照1：5000比例稀释。
11．显色液（Color-substrate solution）: 平衡液中含2％NBT/BCIP储存液。
16.4.2 器材硝酸纤维素滤膜；恒温水浴，塑料带，剪刀，平头镊子，封口机，烤箱，台式高速离心机，高压灭菌锅，电泳仪，水平电泳槽，微量移液器，摇床，吸水纸，3MM Whatman滤纸，干烤皿，玻璃平台等。
16.5方法与操作步骤1．酶切基因组DNA 用一种或是多种限制性内切酶消化适量DNA。
当用标准长度探针（>500bp）杂交检测单拷贝基因时，基因组DNA要求在10μg。
当用寡核苷酸探针时，则需30~50μg DNA。
由于基因组DNA的粘性非常大，所以在用限制性酶切酶切割的时候应该按照以下操作，保证DNA得到均匀分散。
（1)DNA稀释并加入10×限制酶缓冲液于4℃放置数小时，并不时用毛细管温和地搅动DNA溶液。
（2)加入第一种酶后先于4℃搅动2~3min，然后再加热到相应温度。
（3)消化15~30min后再加入第二种酶，于相应温度消化完全。
2．消化DNA的电泳待消化完全后，加入上样缓冲液。
通过0.7％琼脂糖凝胶分离DNA片段，应在4℃缓慢电泳（<5V/cm），待溴酚兰走到离凝胶边缘1cm处时，停止电泳，对凝胶进行拍照。
3．DNA向膜的毛细管转移（1）电泳完毕，将凝胶上无用部分切去，并切去左上角作为标记。
将凝胶置于数倍体积的变性液中浸泡45min，不断温和振摇，使DNA变性。
（2）小心弃去变性缓冲液，用蒸馏水稍加漂洗。
加入至少4倍体积的中和缓冲液，置室温摇床温育15min。
重复1次。
（3）安装转移装置进行DNA印迹。
当凝胶仍然处于中和液中时，用一张Whatman 3MM滤纸包裹一块玻璃板，做成一个略大于凝胶的平台，并将这个平台放于一个大干烤皿中，倒入转移缓冲液10×SSC，使液面略低于平台面，当滤纸湿透后，赶走所有气泡。
裁一张略大于凝胶的滤膜（硝酸纤维膜或尼龙膜），预先用蒸馏水将滤膜浸湿后用20×SSC浸泡至少5min。
切去滤膜的一角，使其与凝胶的切角相对应。
取出凝胶并将其面向下倒扣在滤纸上小心赶出凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中（虹吸短路）将湿润的硝酸纤维素膜至于凝胶上，并在膜上放上两张与膜相同大小的用2×SSC浸湿的3MM 滤纸，小心赶出凝胶与滤纸间的气泡。
放一叠干燥的吸水纸（印迹纸或纸巾）在3MM滤纸上（约5~8cm高）。
置一玻璃板于吸水纸上，其上放一重约500g的重物。
DNA转移可进行12～16h（如过夜）。
当纸巾湿透时应更换新的，并且保持干燥皿中有足够的转移缓冲液。
（4）毛细管恒吸转移完毕，小心拆卸印迹装置。
将膜与凝胶一起转移至干燥的滤纸上，凝胶在上，用软铅笔标记凝胶和滤膜的加样孔位置，去掉凝胶。
（5）用6×SSC漂洗滤膜5min，以去除琼脂糖残迹。
将滤膜放在一张干燥的3MM滤纸上晾干。
（6）将晾干的滤膜夹在两张3MM滤纸之间，在干烤箱中80℃干烤2h。
这时的滤膜已可用于预杂交和杂交处理，或贮存在4℃。
硝酸纤维素膜需真空保存，尼龙膜需用塑料薄膜密封。
注意：Dot blot不需要DNA进行消化、电泳、转膜等过程，而是将待检样品直接点加到预处理好的硝酸纤维素膜上，在干烤箱中80℃干烤2h固定，再进行以下步骤。
4．用DIG试剂盒进行预杂交、杂交（1）预杂交：将适量DIG Easy Hyb加热至杂交温度 37℃~42℃。
将干烤后的硝酸纤维素膜放入一个比膜稍大的塑料袋中，按10ml /100cm2膜的比例加入适量的预杂交液，赶走气泡，封口机封口，42℃预杂交30min。
预杂交过程应缓慢振荡。
（2）探针处理：将制备好的探针于沸水加热5min并迅速放入冰水混合物中。
然后按照一定比例加入到预热的预杂交液中，制成杂交用探针溶液。
加入过程应尽量防止气泡产生。
（3）杂交：弃掉预杂交液，将制备好的探针溶液加入塑料袋中(3.5ml/100cm2膜)。
于杂交温度(37℃ 42℃)，缓慢振荡杂交4h。
（4）洗膜：杂交完毕后，取出膜，室温下，用洗涤液A漂洗膜2次，每次5min。
洗涤过程应不断缓慢振荡。
再在65℃用洗涤液B漂洗膜2次，每次15min。
洗涤过程应不断缓慢振荡。
最后用洗涤液C洗涤膜，室温晃动2min，倒掉洗涤液。
（5）加入100ml封阻液，室温晃动30min，以除去没有特异结合的探针，倒掉封阻液。
（6）加入20ml抗体溶液，室温晃动30min，倒掉溶液。
（7）用洗涤液C室温晃动洗涤膜2次，每次15min，以除去多余的抗体，倒掉洗涤液。
（8）平衡，加入20ml平衡液，室温放置3min，倒掉平衡液。
（9）显色，加入10ml显色液，于黑暗中显色，目标条带显色后用50ml TE终止反应。
注意事项1. 膜的大小及预杂交、杂交过程中所用试剂的量可根据需要进行适当调整。
2．将凝胶中和至中性时，要测pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维素膜。