高效液相体积排阻色谱法分析黄秋葵多糖的单糖组成
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QIU Ya-yu1 ， LI Qiao-ling1 ， CHENG He-yong2 （ 1． Department of Chemistry，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China； 2． Department of Materials，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310058，China）
摘 要： 采用高效液相 （ HPSEC-ＲID） 体积排阻色谱法，建立了 7 种常见单糖的分
离模式，成功地用于黄秋葵多糖的单糖组成分析。应用体积排阻色谱法，色谱柱为
Polyspher CH PB （ 7． 8 mm × 300 mm，made in Germany） ，流动相为去离子水，柱温
80℃ ，示差折光检测器（ 检测器温度 40℃ ） ，流速 0． 6 ml / min 内标为丙三醇。根据
以单糖的浓度 X （ Wi /Ws） 与峰面积 Y（ Ai /As ） 作 图，得回归方程与相关系数。求出各单糖的斜率 b，即 定量较正因子，
f0 fVs = （ Wi / Ws） / （ Ai / As） 式中，Ai、As 分别为 Gly（ 丙三醇） 和标准单糖的 HPLC 峰面积。 1． 4． 3 摩尔比的计算
本研究采用高效液相渗透色谱方法，用示差折光 质量型检测器和磺化的聚苯乙烯二乙烯基苯阳离子交 换树脂（ Pb2 + ） 柱（ 交联度为 6% ） ，用去离子水做流动 相建立适于黄秋葵多糖单糖组成测定的 HPSEC 新方 法，达到灵敏度适宜、安全、快速、准确度高、操作简单 和可在线大批量分析的目标。
1 实验部分
采用 WATEＲS 2690 色谱系统，WATEＲS 2410 示 差折光检测器，检测器温度 40 ℃ ； 柱温 80 ℃ ； 色谱柱 为 Polyspher CH PB （ 7． 8 mm × 300 mm，made in Germany） ； 流速 0． 6 mL / min； 流动相为去离子水； 进样 体积 50 μL 。 1． 4 分析原理与方法 1． 4． 1 定量校正因子
以 Gly（ 丙三醇） 为内标，测定 7 种单糖的定量较
正因 子 （ fVs ） 。 精 密 称 取 各 标 准 单 糖，并 配 制 成 2 mmol / L的母液，用 时 稀 释 为 5 个 不 同 浓 度 的 单 糖 溶 液，并进行 HPLC 分析 （ 线性范围 1 ～ 10 mmol） 。 1． 4． 2 相关系数与回归方程
水溶性成分。药理学研究表明，这种由水溶性纤维果 胶、半乳聚糖和阿拉伯树胶等组成的黄秋葵粗多糖，具 有保护肠胃、肝脏和皮肤粘膜作用［1 ～ 3］，并能刺激中枢 神经，加速血液循环及促进新陈代谢和全身血 管 活 化［4］，可防治因血管供血不足造成的心脏病、中风、骨 质疏松及老年痴呆等疾病［5］，因此对黄秋葵粗多糖的 成分研究很有必要。由于粗多糖由各种基本的中性单 糖组成的，因此对单糖组成测定是控制多糖质量标准 和提供多糖基本信息的最重要环节之一［6-8］。而单糖
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实验室研究与探索
第 33 卷
存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征［9］，且 往往同一待测样品，如多糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等可能 含有许多类型的单糖［10-11］，所以单糖分析有其自身的 特点，必须具有高效的分离技术，方可实现系列单糖的 有效分离。罗利攀等用 GC-MS 方法［12］对不同产地的 红景天多糖进行单糖组分分析，虽然 MS 检测器灵敏 度很高，但需要对单糖进行衍生化处理，过程繁琐且衍 生化是否充分大大影响测定结果； 王松柏等用毛细管 电泳法［13］测定防 风 粗 多 糖 的 单 糖 组 分 研 究 同 样 存 在 柱前衍生 的 缺 点； 其 他 诸 如 用 HPLC 反 相 柱 方 法 测 定［14］绞股蓝粗多 糖 的 单 糖 组 成 存 在 分 离 度 较 差 且 流 动相需用到大量乙腈等有毒试剂的明显缺点。
以 Gly 为内标，得到各单糖的峰面积与内标的峰 面积比，乘以 f / m （ m 为单糖的相对分子质量） ，所得 的值之比为摩尔比来自百度文库即：
ＲVs = fVs （ Ai / As ） / m
2 结果与讨论
2． 1 单糖对照品的 HPLC 分离 为实现黄秋葵粗多糖各组成单糖的高效分离，本
实验对黄秋葵粗多糖可能包含的葡萄糖 （ Glc） 、阿拉 伯糖 （ Ara ） 、甘 露 糖 （ Man ） 、半 乳 糖 （ Ga1 ） 、鼠 李 糖 （ Ｒha） 、木糖 （ Xy1） 、果糖（ FＲU） ） 7 种标准单糖及内 标 Gly 的高效液相色谱分离条件进行了优化。结果表 明，在 2． 5 mmol / L 醋酸水溶液，5 mmol / L 醋酸水溶液 和 去离子水三者之间选择，去离子水中的分辨率高， 分离效率最好，且样品容量大，因此去离子水为分离此 7 种单糖的较理想色谱分离条件。色谱峰的各峰保留 时间依次为内标 Gly，葡萄糖（ Glc） 、阿拉伯糖（ Ara） 、 甘露糖 （ Man ） 、半 乳 糖 （ Ga1 ） 、鼠 李 糖 （ Ｒha ） 、果 糖 （ FＲU） 以及木糖 （ Xy1） 。其中，内标 Gly 与其他单糖 有很好的分离，其作为内标是合适的。 2． 2 多糖水解样品制备条件优化
关键词： 黄秋葵多糖； 单糖组成； 高效液相体积排阻色谱法
中图分类号： Ｒ 284． 1
文献标志码： A
文章编号： 1006 － 7167（ 2014） 12 － 0027 － 04
Analysis of Monosaccharide Composition in Okra Polysaccharides by High Performance Liquid Chromatography
5 － 鼠李糖，6 － 果糖，7 － 木糖
图 1 黄秋葵多糖水解样品对单糖组成测定结果的影响
水解时间的延长，测定的单糖摩尔比率增加，而在 110 ℃ 用 2 mmol / L TFA 水解 8 h 后，水解已完全。可见，
图 2 黄秋葵多糖经 TFA 水解的时间对各组成单糖的测定影响
Abstract： A method of analysis the monosaccharide composition of Okre polysaccharides with good reproducibility is established in thhi paper． The method is to base on HPSEC-ＲID method and chromatographic conditions that inc1ude Polyspher CH PB （ 7． 8 mm × 300 mm，made in Germany） column． The mobile phase is pure water at 40℃ of the column and the ＲID detector is 80℃ ． The method of HPSEC-ＲID analysis showed that Okra polysaccharides consists of xylose，mannose，rhamnose，glucose，fructose，galactose and arabonose with the molar ratios of 0． 57∶ 1． 00∶ 0． 53∶ 3． 50∶ 1． 75∶ 1． 25∶ 1． 70． It was proved that the HPSEC-ＲID method is simple，rapid，sensitive，convenient，and can be applied to the quality control of the monosaccharide composition of Okra polysaccharides． Key words： Okra polysaccharides； monosaccharide composition； HPSEC-ＲID
精确称取黄秋葵多糖样品 20． 0 mg 于安瓿中，分 别加入 2 mol / L TFA、2 mol / L H2 SO4 以及其混酸溶液 2． 0 mL，充氮气封管，110 ℃ 油浴分别水解 2、4、6、8 和 10 h。冷 却 至 室 温，反 应 混 合 物 1 000 r / min 离 心 5 min，取上清液用 0． 3 mol / L NaOH 溶液中和到约 pH 7． 0。 1． 3 HPLC 分析方法
多糖水解样品的制备通常要经复杂的干燥过程， 方可进行下一步的分析。本样品制备方法省略干燥过 程，而将多糖水解液直接用 NaOH 中和（ 约中性） ，这 对于发展多糖的定性定量在线分析技术有重要的实际 意义。该制备方法的特点是： ① 简化工艺，避免干燥 损失。② 该多糖水解样品制备过程对多糖的组成测 定无影响。图 1 是黄秋葵多糖经 TFA 水解后，水解液 经传统的干燥过程和未经干燥过程的 HPLC 图，图中 未发现有明显吸收峰改变。③ 对多糖的含量、单糖组 成等定量分析更有意义，因此过程几乎无糖损失，多糖 水解液可直接进行在线大批量分析监测。 2． 3 黄秋葵多糖样品的单糖组成分析 2． 3． 1 多糖水解时间对分析结果的影响
1． 1 仪器和试剂 WATEＲS 2690 液 相 色 谱 仪 （ 美 国 WATEＲS 公
司） ； PＲE-PACKED COLUMN ＲT POLYSPHEＲ CH PB 分析糖 柱 （ 德 国 MEＲCK 公 司） ； 旋 转 蒸 发 仪 （ 瑞 士 BUCHI 公 司 ） ； EZ-DＲY 冷 冻 干 燥 机 （ 美 国 Filter 公 司） 。三氟乙酸（ TFA，Merck 公司） ； 甲醇（ 色谱纯，天 津市科密欧化学试剂） ； 乙腈 （ TEDIA 公司） ； 葡萄糖 （ Glc） 、阿拉伯糖（ Ara） 、甘露糖（ Man） 、半乳糖（ Ga1） 、 鼠李糖（ Ｒha） 、木糖 （ Xy1） 、果糖（ FＲU） ，丙三醇（ Gly） 均购自 Sigma 公司，其他试剂均为分析纯。黄秋葵多 糖由本教研室制备。 1． 2 黄秋葵多糖水解
建立的方法测定，黄秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉
伯糖 7 种单糖组成，其摩尔比分别为 0． 57∶ 1． 00∶ 0． 53∶ 3． 50∶ 1． 75∶ 1． 25∶ 1． 70。该
HPSEC-ＲID 方法是简单、快速、灵敏、方便的分析技术，具有良好的重复性，可用于
黄秋葵多糖的单糖组成的质量控制。
考察了 TFA 的不同水解时间对黄秋葵多糖的组 成测定结果的影响，结果如图2 所示。黄秋葵多糖随
第 12 期
裘雅渔，等： 高效液相体积排阻色谱法分析黄秋葵多糖的单糖组成
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黄秋葵多糖经 TFA 水解 8 h 为其合适的水解时间。
（ a） 干燥
（ b） 无干燥 1 － 葡萄糖，2 － 阿拉伯糖，3 － 甘露糖，4 － 半乳糖，
0引言
黄秋葵单糖是从黄秋葵粗多糖酸水解后得到单糖 组分，而黄秋葵粗多糖又是从黄秋葵嫩荚果中提取的
收稿日期： 2014 － 02 － 10 基金项目： 浙江省科技厅测试基金项目（ 2012C37070 ） 作者简介： 裘雅渔（ 1975 － ） ，女，浙江绍兴人，硕士，工程师，主要 从事天然药物提取和分析。 Tel． ： 15958048922； E-mail： xuhua319@ zju． edu． cn
第 33 卷 第 12 期 2014 年 12 月
实验室研究与探索
ＲESEAＲCH AND EXPLOＲATION IN LABOＲATOＲY
Vol． 33 No． 12 Dec． 2014
高效液相体积排阻色谱法分析黄秋葵多糖的单糖组成
裘雅渔1， 李巧玲1， 程和勇2
（ 1． 浙江大学 化学系，浙江 杭州 310027； 2． 杭州师范大学 材料系，浙江 杭州 310058）
摘 要： 采用高效液相 （ HPSEC-ＲID） 体积排阻色谱法，建立了 7 种常见单糖的分
离模式，成功地用于黄秋葵多糖的单糖组成分析。应用体积排阻色谱法，色谱柱为
Polyspher CH PB （ 7． 8 mm × 300 mm，made in Germany） ，流动相为去离子水，柱温
80℃ ，示差折光检测器（ 检测器温度 40℃ ） ，流速 0． 6 ml / min 内标为丙三醇。根据
以单糖的浓度 X （ Wi /Ws） 与峰面积 Y（ Ai /As ） 作 图，得回归方程与相关系数。求出各单糖的斜率 b，即 定量较正因子，
f0 fVs = （ Wi / Ws） / （ Ai / As） 式中，Ai、As 分别为 Gly（ 丙三醇） 和标准单糖的 HPLC 峰面积。 1． 4． 3 摩尔比的计算
本研究采用高效液相渗透色谱方法，用示差折光 质量型检测器和磺化的聚苯乙烯二乙烯基苯阳离子交 换树脂（ Pb2 + ） 柱（ 交联度为 6% ） ，用去离子水做流动 相建立适于黄秋葵多糖单糖组成测定的 HPSEC 新方 法，达到灵敏度适宜、安全、快速、准确度高、操作简单 和可在线大批量分析的目标。
1 实验部分
采用 WATEＲS 2690 色谱系统，WATEＲS 2410 示 差折光检测器，检测器温度 40 ℃ ； 柱温 80 ℃ ； 色谱柱 为 Polyspher CH PB （ 7． 8 mm × 300 mm，made in Germany） ； 流速 0． 6 mL / min； 流动相为去离子水； 进样 体积 50 μL 。 1． 4 分析原理与方法 1． 4． 1 定量校正因子
以 Gly（ 丙三醇） 为内标，测定 7 种单糖的定量较
正因 子 （ fVs ） 。 精 密 称 取 各 标 准 单 糖，并 配 制 成 2 mmol / L的母液，用 时 稀 释 为 5 个 不 同 浓 度 的 单 糖 溶 液，并进行 HPLC 分析 （ 线性范围 1 ～ 10 mmol） 。 1． 4． 2 相关系数与回归方程
水溶性成分。药理学研究表明，这种由水溶性纤维果 胶、半乳聚糖和阿拉伯树胶等组成的黄秋葵粗多糖，具 有保护肠胃、肝脏和皮肤粘膜作用［1 ～ 3］，并能刺激中枢 神经，加速血液循环及促进新陈代谢和全身血 管 活 化［4］，可防治因血管供血不足造成的心脏病、中风、骨 质疏松及老年痴呆等疾病［5］，因此对黄秋葵粗多糖的 成分研究很有必要。由于粗多糖由各种基本的中性单 糖组成的，因此对单糖组成测定是控制多糖质量标准 和提供多糖基本信息的最重要环节之一［6-8］。而单糖
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实验室研究与探索
第 33 卷
存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征［9］，且 往往同一待测样品，如多糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等可能 含有许多类型的单糖［10-11］，所以单糖分析有其自身的 特点，必须具有高效的分离技术，方可实现系列单糖的 有效分离。罗利攀等用 GC-MS 方法［12］对不同产地的 红景天多糖进行单糖组分分析，虽然 MS 检测器灵敏 度很高，但需要对单糖进行衍生化处理，过程繁琐且衍 生化是否充分大大影响测定结果； 王松柏等用毛细管 电泳法［13］测定防 风 粗 多 糖 的 单 糖 组 分 研 究 同 样 存 在 柱前衍生 的 缺 点； 其 他 诸 如 用 HPLC 反 相 柱 方 法 测 定［14］绞股蓝粗多 糖 的 单 糖 组 成 存 在 分 离 度 较 差 且 流 动相需用到大量乙腈等有毒试剂的明显缺点。
以 Gly 为内标，得到各单糖的峰面积与内标的峰 面积比，乘以 f / m （ m 为单糖的相对分子质量） ，所得 的值之比为摩尔比来自百度文库即：
ＲVs = fVs （ Ai / As ） / m
2 结果与讨论
2． 1 单糖对照品的 HPLC 分离 为实现黄秋葵粗多糖各组成单糖的高效分离，本
实验对黄秋葵粗多糖可能包含的葡萄糖 （ Glc） 、阿拉 伯糖 （ Ara ） 、甘 露 糖 （ Man ） 、半 乳 糖 （ Ga1 ） 、鼠 李 糖 （ Ｒha） 、木糖 （ Xy1） 、果糖（ FＲU） ） 7 种标准单糖及内 标 Gly 的高效液相色谱分离条件进行了优化。结果表 明，在 2． 5 mmol / L 醋酸水溶液，5 mmol / L 醋酸水溶液 和 去离子水三者之间选择，去离子水中的分辨率高， 分离效率最好，且样品容量大，因此去离子水为分离此 7 种单糖的较理想色谱分离条件。色谱峰的各峰保留 时间依次为内标 Gly，葡萄糖（ Glc） 、阿拉伯糖（ Ara） 、 甘露糖 （ Man ） 、半 乳 糖 （ Ga1 ） 、鼠 李 糖 （ Ｒha ） 、果 糖 （ FＲU） 以及木糖 （ Xy1） 。其中，内标 Gly 与其他单糖 有很好的分离，其作为内标是合适的。 2． 2 多糖水解样品制备条件优化
关键词： 黄秋葵多糖； 单糖组成； 高效液相体积排阻色谱法
中图分类号： Ｒ 284． 1
文献标志码： A
文章编号： 1006 － 7167（ 2014） 12 － 0027 － 04
Analysis of Monosaccharide Composition in Okra Polysaccharides by High Performance Liquid Chromatography
5 － 鼠李糖，6 － 果糖，7 － 木糖
图 1 黄秋葵多糖水解样品对单糖组成测定结果的影响
水解时间的延长，测定的单糖摩尔比率增加，而在 110 ℃ 用 2 mmol / L TFA 水解 8 h 后，水解已完全。可见，
图 2 黄秋葵多糖经 TFA 水解的时间对各组成单糖的测定影响
Abstract： A method of analysis the monosaccharide composition of Okre polysaccharides with good reproducibility is established in thhi paper． The method is to base on HPSEC-ＲID method and chromatographic conditions that inc1ude Polyspher CH PB （ 7． 8 mm × 300 mm，made in Germany） column． The mobile phase is pure water at 40℃ of the column and the ＲID detector is 80℃ ． The method of HPSEC-ＲID analysis showed that Okra polysaccharides consists of xylose，mannose，rhamnose，glucose，fructose，galactose and arabonose with the molar ratios of 0． 57∶ 1． 00∶ 0． 53∶ 3． 50∶ 1． 75∶ 1． 25∶ 1． 70． It was proved that the HPSEC-ＲID method is simple，rapid，sensitive，convenient，and can be applied to the quality control of the monosaccharide composition of Okra polysaccharides． Key words： Okra polysaccharides； monosaccharide composition； HPSEC-ＲID
精确称取黄秋葵多糖样品 20． 0 mg 于安瓿中，分 别加入 2 mol / L TFA、2 mol / L H2 SO4 以及其混酸溶液 2． 0 mL，充氮气封管，110 ℃ 油浴分别水解 2、4、6、8 和 10 h。冷 却 至 室 温，反 应 混 合 物 1 000 r / min 离 心 5 min，取上清液用 0． 3 mol / L NaOH 溶液中和到约 pH 7． 0。 1． 3 HPLC 分析方法
多糖水解样品的制备通常要经复杂的干燥过程， 方可进行下一步的分析。本样品制备方法省略干燥过 程，而将多糖水解液直接用 NaOH 中和（ 约中性） ，这 对于发展多糖的定性定量在线分析技术有重要的实际 意义。该制备方法的特点是： ① 简化工艺，避免干燥 损失。② 该多糖水解样品制备过程对多糖的组成测 定无影响。图 1 是黄秋葵多糖经 TFA 水解后，水解液 经传统的干燥过程和未经干燥过程的 HPLC 图，图中 未发现有明显吸收峰改变。③ 对多糖的含量、单糖组 成等定量分析更有意义，因此过程几乎无糖损失，多糖 水解液可直接进行在线大批量分析监测。 2． 3 黄秋葵多糖样品的单糖组成分析 2． 3． 1 多糖水解时间对分析结果的影响
1． 1 仪器和试剂 WATEＲS 2690 液 相 色 谱 仪 （ 美 国 WATEＲS 公
司） ； PＲE-PACKED COLUMN ＲT POLYSPHEＲ CH PB 分析糖 柱 （ 德 国 MEＲCK 公 司） ； 旋 转 蒸 发 仪 （ 瑞 士 BUCHI 公 司 ） ； EZ-DＲY 冷 冻 干 燥 机 （ 美 国 Filter 公 司） 。三氟乙酸（ TFA，Merck 公司） ； 甲醇（ 色谱纯，天 津市科密欧化学试剂） ； 乙腈 （ TEDIA 公司） ； 葡萄糖 （ Glc） 、阿拉伯糖（ Ara） 、甘露糖（ Man） 、半乳糖（ Ga1） 、 鼠李糖（ Ｒha） 、木糖 （ Xy1） 、果糖（ FＲU） ，丙三醇（ Gly） 均购自 Sigma 公司，其他试剂均为分析纯。黄秋葵多 糖由本教研室制备。 1． 2 黄秋葵多糖水解
建立的方法测定，黄秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉
伯糖 7 种单糖组成，其摩尔比分别为 0． 57∶ 1． 00∶ 0． 53∶ 3． 50∶ 1． 75∶ 1． 25∶ 1． 70。该
HPSEC-ＲID 方法是简单、快速、灵敏、方便的分析技术，具有良好的重复性，可用于
黄秋葵多糖的单糖组成的质量控制。
考察了 TFA 的不同水解时间对黄秋葵多糖的组 成测定结果的影响，结果如图2 所示。黄秋葵多糖随
第 12 期
裘雅渔，等： 高效液相体积排阻色谱法分析黄秋葵多糖的单糖组成
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黄秋葵多糖经 TFA 水解 8 h 为其合适的水解时间。
（ a） 干燥
（ b） 无干燥 1 － 葡萄糖，2 － 阿拉伯糖，3 － 甘露糖，4 － 半乳糖，
0引言
黄秋葵单糖是从黄秋葵粗多糖酸水解后得到单糖 组分，而黄秋葵粗多糖又是从黄秋葵嫩荚果中提取的
收稿日期： 2014 － 02 － 10 基金项目： 浙江省科技厅测试基金项目（ 2012C37070 ） 作者简介： 裘雅渔（ 1975 － ） ，女，浙江绍兴人，硕士，工程师，主要 从事天然药物提取和分析。 Tel． ： 15958048922； E-mail： xuhua319@ zju． edu． cn
第 33 卷 第 12 期 2014 年 12 月
实验室研究与探索
ＲESEAＲCH AND EXPLOＲATION IN LABOＲATOＲY
Vol． 33 No． 12 Dec． 2014
高效液相体积排阻色谱法分析黄秋葵多糖的单糖组成
裘雅渔1， 李巧玲1， 程和勇2
（ 1． 浙江大学 化学系，浙江 杭州 310027； 2． 杭州师范大学 材料系，浙江 杭州 310058）