血涂片的制备与染色(29)
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血涂片的制备与染色
血涂片的制备
◈ 制备合格的血涂片，是血液学检查的最基本的技 术和方法， ◈ 血片的质量及染色的好坏，直接影响到细胞形 态的观察、和诊断。
（一） 载玻片的清洁
1. 新玻片：常带有游离碱质，用1mol/L HCl 浸泡24h， 清水冲净，干燥备用。
2. 用过的玻片：肥皂（洗涤剂）水煮沸20 min，再用 热水将肥皂和血膜洗净，清水反复冲洗，干燥备用。
3. 自动推片机法
标准化 自动化 智能化
第四部分 血细胞常用的染色方法
细胞染色技术
细胞涂片，在光学显微镜观察之前需要固定、染色。
固定：将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联和凝固，
以保持细胞原有的形态结构不发生变化。
染色目的：使细胞的主要结构（细胞质、细胞核、
细胞器等）染上不同的颜色，便于显微镜下观察。
Hale Waihona Puke 碱性美蓝结合，偏碱：出现异常蓝染。 ⓑ PH<PI: 酸性环境，蛋白质分子带正电荷多，易与酸
性伊红结合，因此偏酸：氢离子较多，降低对碱性染料 的亲和力，增强伊红着色，出现异常红染。
最佳PH：6.4～6.8，应使用缓冲液。
同时使用优质甲醇（AR）和清洁的中性玻片。
【染色方法】
以血涂片为例 ① 血膜干后，在两端用蜡笔化线，平放在染
色架上； ② 加染液数滴，固定1min； ③ 加等量或稍多的缓冲液，与染液充分混匀，
有一定的空隙（0.3cm和1.5cm），血膜长度
占载玻片的2/3左右。玻片的一端应留有贴标
签的地方。
0.3cm
临
沂 市
1.5cm
人
民
医
院
制血膜
白细胞显微镜分类
瑞氏染色
显微镜分类
白细胞分类镜检部位及计数方法
血涂片注意事项
注意血滴大小、推片角度（25～30°角）速度、用力均匀； 注意HCT及血液粘稠度 每次使用清洁的推片，以免异常细胞的相互污染。 涂片制成后，在空气中挥动，使其迅速干燥，天气寒冷或
潮湿时，置37℃温箱干燥。 干燥后编号
2. 厚血膜涂片法
末梢血1滴（约20μl）于玻片中央，用推片一角 将血由内向外旋转涂布，制成厚薄均匀、直径约1.5cm 的圆形血膜，自然干燥后，滴加数滴蒸馏水，使RBC 溶解，脱去血红蛋白，将水倒掉，血膜呈灰白色，干 后染色镜检。
特点：血量多，待检成分集中。 适用于：疟原虫、微丝蚴等检查
常用的染色方法：有瑞氏、姬姆萨、巴氏、HE染
色等。
细胞染色法类型
1 普通染色法：如Wright、Giemsa、Papanicolaou、HE染 色法等。
2 荧光染色法：如吖啶橙荧光染色，使细胞内DNA呈现黄 绿色荧光，使RNA显桔红色荧光。用于精子 和阴道分泌物的的细胞检查。
3 细胞活体染色法：活体染料有灿烂甲酚蓝、新亚甲蓝、中 性红等，如RET染色。
4 细胞化学染色法：利用化学反应显示细胞内某些成分的存 在和数量。被显示的物质有核酸、蛋白质、脂类、糖类、 酶类及其他物质等。近年来，把单克隆抗体技术、酶标记 技术等应用于细胞化学染色中，发展成为细胞免疫化学染 色法。能特异、灵敏地显示细胞内的一些抗原和半抗原物 质，应用越来越广泛。
1. 碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核 的染料。如亚甲蓝、天青。
(三)血涂片的制备
方法： 手工推片法 自动推片法 厚膜涂片法等
取血约50ul,将推玻片向1的方向稍抽回，当 血液充满推玻片的宽度后，以一定均匀的 速度向2的方向滑动。
注意：血滴大，速度快、角度大----血膜厚
* 一张良好的血片要求：
厚薄适宜，头、体、尾分明，边缘整齐，细胞
分布均匀；血膜与载玻片的两边和两端分别留
美蓝和伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水 的伊红化美蓝（ME）中性沉淀，即瑞氏染料。
将瑞氏染料用适量甲醇溶解，即成为瑞氏染液
甲醇
ME
M+ + E-
Wright染液配制：
瑞氏染粉 0.1g 甲醇（AR） 60.0ml ①研磨法； ②直接溶解法 配好的染液置室温一周后使用，时间越长效果越 好，久置时应密封，防止甲醇挥发和氧化，也可加甘 油3ml，防挥发且细胞着色清晰
甲醇作用：
① 作为溶剂: ② 能将瑞氏染料解离成带正电荷的天青B和带负
电荷的伊红。 ③ 固定细胞（脱水） ④ 使蛋白沉淀成颗粒状、网状结构，增加与染
料的接触面积，提高对染料的吸附作用，增强 染色效果。
* 2.细胞的着色原理
既有化学的亲和作用，又有物理的吸附作用。 不同的细胞因其所含的化学成分不同，对燃料的亲和力也不同。 ①细胞中的碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，该物质又
称嗜酸性物质（Hb、嗜酸性颗粒等）。 ②细胞中的酸性物质与碱性染料美蓝结合染成蓝色，该物质又
称嗜碱性物质（如嗜碱性颗粒、淋巴细胞胞浆等） ③中性颗粒呈等电状态，与伊红美蓝均能结合，染成紫红色
3.环境PH值对细胞染色的影响
细胞成分多为蛋白质，蛋白质具有两性电离，环境PH 值决定其带电荷的多少，对H+浓度较敏感 。 ⓐ PH>PI: 碱性环境，蛋白质分子带负电荷多，易与
2. 酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧 烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合 细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、 嗜酸性颗粒成分等。
3. 复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料
（一） 瑞氏(Wright) 染色
Wright 和Giemsa 都是在Romanowsky染色法基础
上演变而来，都是含有伊红和美蓝的复合燃料。瑞
氏染色法常用于血液、其他体液、分泌物、排泄物等 涂片中各种细胞的染色。 特点：① 将固定和染色和在一起进行，
② 操作简单，染色时间短， ③ 对WBC胞质中的特异性颗粒着色较好，但 对核的着色略差。
1.瑞氏染液
由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。
伊红是钠盐，有色部分为阴离子，
美蓝是氯盐，有色部分为阳离子。
3. 急用玻片：置0.95L/L乙醇中浸泡1h，蒸馏水洗净后， 擦干或烘干备用。
(二)制作血涂片的标本
最好用非抗凝的静脉血和毛细血管血， 也可用EDTA抗凝血制备。
EDTA抗凝血中，因Ca2+被螯和，阻止PLT的聚集， 推片时PLT均匀平铺，显微镜下易于观察其形态，但有 时会看到EDTA引起的RBC皱缩及WBC丛集现象，应注意。 随着全自动血细胞分析仪的普及，多用EDTA抗凝血。 有些血细胞检查流水线，还可自动推片、染色。
血涂片的制备
◈ 制备合格的血涂片，是血液学检查的最基本的技 术和方法， ◈ 血片的质量及染色的好坏，直接影响到细胞形 态的观察、和诊断。
（一） 载玻片的清洁
1. 新玻片：常带有游离碱质，用1mol/L HCl 浸泡24h， 清水冲净，干燥备用。
2. 用过的玻片：肥皂（洗涤剂）水煮沸20 min，再用 热水将肥皂和血膜洗净，清水反复冲洗，干燥备用。
3. 自动推片机法
标准化 自动化 智能化
第四部分 血细胞常用的染色方法
细胞染色技术
细胞涂片，在光学显微镜观察之前需要固定、染色。
固定：将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联和凝固，
以保持细胞原有的形态结构不发生变化。
染色目的：使细胞的主要结构（细胞质、细胞核、
细胞器等）染上不同的颜色，便于显微镜下观察。
Hale Waihona Puke 碱性美蓝结合，偏碱：出现异常蓝染。 ⓑ PH<PI: 酸性环境，蛋白质分子带正电荷多，易与酸
性伊红结合，因此偏酸：氢离子较多，降低对碱性染料 的亲和力，增强伊红着色，出现异常红染。
最佳PH：6.4～6.8，应使用缓冲液。
同时使用优质甲醇（AR）和清洁的中性玻片。
【染色方法】
以血涂片为例 ① 血膜干后，在两端用蜡笔化线，平放在染
色架上； ② 加染液数滴，固定1min； ③ 加等量或稍多的缓冲液，与染液充分混匀，
有一定的空隙（0.3cm和1.5cm），血膜长度
占载玻片的2/3左右。玻片的一端应留有贴标
签的地方。
0.3cm
临
沂 市
1.5cm
人
民
医
院
制血膜
白细胞显微镜分类
瑞氏染色
显微镜分类
白细胞分类镜检部位及计数方法
血涂片注意事项
注意血滴大小、推片角度（25～30°角）速度、用力均匀； 注意HCT及血液粘稠度 每次使用清洁的推片，以免异常细胞的相互污染。 涂片制成后，在空气中挥动，使其迅速干燥，天气寒冷或
潮湿时，置37℃温箱干燥。 干燥后编号
2. 厚血膜涂片法
末梢血1滴（约20μl）于玻片中央，用推片一角 将血由内向外旋转涂布，制成厚薄均匀、直径约1.5cm 的圆形血膜，自然干燥后，滴加数滴蒸馏水，使RBC 溶解，脱去血红蛋白，将水倒掉，血膜呈灰白色，干 后染色镜检。
特点：血量多，待检成分集中。 适用于：疟原虫、微丝蚴等检查
常用的染色方法：有瑞氏、姬姆萨、巴氏、HE染
色等。
细胞染色法类型
1 普通染色法：如Wright、Giemsa、Papanicolaou、HE染 色法等。
2 荧光染色法：如吖啶橙荧光染色，使细胞内DNA呈现黄 绿色荧光，使RNA显桔红色荧光。用于精子 和阴道分泌物的的细胞检查。
3 细胞活体染色法：活体染料有灿烂甲酚蓝、新亚甲蓝、中 性红等，如RET染色。
4 细胞化学染色法：利用化学反应显示细胞内某些成分的存 在和数量。被显示的物质有核酸、蛋白质、脂类、糖类、 酶类及其他物质等。近年来，把单克隆抗体技术、酶标记 技术等应用于细胞化学染色中，发展成为细胞免疫化学染 色法。能特异、灵敏地显示细胞内的一些抗原和半抗原物 质，应用越来越广泛。
1. 碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核 的染料。如亚甲蓝、天青。
(三)血涂片的制备
方法： 手工推片法 自动推片法 厚膜涂片法等
取血约50ul,将推玻片向1的方向稍抽回，当 血液充满推玻片的宽度后，以一定均匀的 速度向2的方向滑动。
注意：血滴大，速度快、角度大----血膜厚
* 一张良好的血片要求：
厚薄适宜，头、体、尾分明，边缘整齐，细胞
分布均匀；血膜与载玻片的两边和两端分别留
美蓝和伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水 的伊红化美蓝（ME）中性沉淀，即瑞氏染料。
将瑞氏染料用适量甲醇溶解，即成为瑞氏染液
甲醇
ME
M+ + E-
Wright染液配制：
瑞氏染粉 0.1g 甲醇（AR） 60.0ml ①研磨法； ②直接溶解法 配好的染液置室温一周后使用，时间越长效果越 好，久置时应密封，防止甲醇挥发和氧化，也可加甘 油3ml，防挥发且细胞着色清晰
甲醇作用：
① 作为溶剂: ② 能将瑞氏染料解离成带正电荷的天青B和带负
电荷的伊红。 ③ 固定细胞（脱水） ④ 使蛋白沉淀成颗粒状、网状结构，增加与染
料的接触面积，提高对染料的吸附作用，增强 染色效果。
* 2.细胞的着色原理
既有化学的亲和作用，又有物理的吸附作用。 不同的细胞因其所含的化学成分不同，对燃料的亲和力也不同。 ①细胞中的碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，该物质又
称嗜酸性物质（Hb、嗜酸性颗粒等）。 ②细胞中的酸性物质与碱性染料美蓝结合染成蓝色，该物质又
称嗜碱性物质（如嗜碱性颗粒、淋巴细胞胞浆等） ③中性颗粒呈等电状态，与伊红美蓝均能结合，染成紫红色
3.环境PH值对细胞染色的影响
细胞成分多为蛋白质，蛋白质具有两性电离，环境PH 值决定其带电荷的多少，对H+浓度较敏感 。 ⓐ PH>PI: 碱性环境，蛋白质分子带负电荷多，易与
2. 酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧 烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合 细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、 嗜酸性颗粒成分等。
3. 复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料
（一） 瑞氏(Wright) 染色
Wright 和Giemsa 都是在Romanowsky染色法基础
上演变而来，都是含有伊红和美蓝的复合燃料。瑞
氏染色法常用于血液、其他体液、分泌物、排泄物等 涂片中各种细胞的染色。 特点：① 将固定和染色和在一起进行，
② 操作简单，染色时间短， ③ 对WBC胞质中的特异性颗粒着色较好，但 对核的着色略差。
1.瑞氏染液
由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。
伊红是钠盐，有色部分为阴离子，
美蓝是氯盐，有色部分为阳离子。
3. 急用玻片：置0.95L/L乙醇中浸泡1h，蒸馏水洗净后， 擦干或烘干备用。
(二)制作血涂片的标本
最好用非抗凝的静脉血和毛细血管血， 也可用EDTA抗凝血制备。
EDTA抗凝血中，因Ca2+被螯和，阻止PLT的聚集， 推片时PLT均匀平铺，显微镜下易于观察其形态，但有 时会看到EDTA引起的RBC皱缩及WBC丛集现象，应注意。 随着全自动血细胞分析仪的普及，多用EDTA抗凝血。 有些血细胞检查流水线，还可自动推片、染色。