第二章 酶促反应动力学

2.3.1.2 酶和细胞固定化方法
物理吸附法 载体结合法 离子结合法 共价结合法 交联法 格子型 包埋法 微胶囊
交联法
O O E O E E O E
2.3.1.3 固定化对酶性质的影响
• 底物专一性的改变
• 稳定性增强
• 最适pH值和最适温度变化
• 动力学参数的变化
2.3.1.4
影响固定化酶促反应的主要因素
解之,得
式中:
可见,产物抑制属于竞争性抵制
底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓 度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底 物抑制。 r
CS
CS
底物抑制反应机理：
快速平衡法推导动学方程：
解之,得
式中:
2.2.3 多底物酶促反应动力学
一般的多底物酶促反应可表示为：
这里讨论：双底物双产物情况
反应机制：
CA不断减少，为使rA恒为正，所以式前 要加负号 式中， k：酶促反应速率常数； r：酶促反应速率； rA：以底物A的消耗速率表示的酶促反应速率； rP：以产物P的生成速率表示的酶促反应速率(P指C或D)。
对连锁的酶促反应，
2.2.2 单底物酶促反应动力学 2.2.2.1 米氏方程 根据酶－底物中间复合物假说，对 单底物酶促反应 ，其反应机制可 表示为：
关键问题：底物A、B哪个先和酶结合？ 任何一个都有可能先与酶结合 （随机机制） A先与酶结合或B先与酶结合

两底物同时与酶结合
（可能性极小）
随机机制（分支机制）
EB E EA EAB EPQ EQ
EP E
（不形成三元复合物）反应模型
＋A
E
－P
－A
EA
EG
＋B －B
－Q
＋P
EQ
＋Q
E
（ EG：修饰过的酶 ）
式中:
表明C*为Da准数的函数，即
(
时,
)
表明
为C*的函数，即
可见，Da准数是决定效率因子 准数。
和比浓度C*的唯
一参数，因而是表征传质过程对反应速率影响的基本
Da准数越小，固定化酶表面浓度越接近于主体浓度
CS， 越接近于1。Da准数越大，固定化酶表面浓度
越趋近于零，
越小，越趋近于零。
为提高固定化酶外扩散效率,应设法减小Da 准数。减小Da准数的措施： 1、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面 积，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应 用中综合考虑，确定合适的粒径。 2、使固定化酶表面流体处于湍流状态以增 大 。
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2.1 酶促反应动力学的特点
2.1.1 酶的基本概念 2.1.2 酶的稳定性及应用特点 酶是以活力、而不是以质量购销的。 酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药 用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺 条件所需纯度更高的酶。
经典酶学研究中，酶反应速率的测定是在反应 的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较 低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应 的机制。 工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要 使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持续较长时 间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机 溶剂中进行。
2.2.2.2 抑制剂对酶促反应速率的影响 失活作用: 使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用 抑制作用:使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性
的作用
不可逆抑制 可逆抑制
竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制
竞争性抑制
非竞争性抑制
S
S
I
I E
E
• 竞争性抑制：抑制剂与底物竞争，从而阻止底 物与酶的结合。因酶的活性中心不能同时与抑 制剂(I)作用，又与底物(S)作用。竞争性抑制剂 具有与底物相类似的结构，与酶形成可逆的EI 复合物，但EI不能分解成产物P。 • 非竞争性抑制：酶可以同时与底物及抑制剂结 合，两者没有竞争作用。但是ESI复合体不能进 一步分解为产物，因此酶活性降低。
2.2 均相酶促反应动力学 2.2.1 酶促反应动力学基础 可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学 方程。
一步简单反应
（ 1）
对（1）式从0-t（CA0到CA）进行积分可得
2.2 均相酶促反应动力学 2.2.1 酶促反应动力学基础 可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。 对酶促反应 ，有：
双倒数法(Linewear Burk): 对米氏方程两侧取倒数，得
,以 作图，得一直线， 直线斜率为 ，截距为 ,根据直线 斜率和截距可计算出Km和rmax。
1／r
1／rmax
斜率－Km/rmax
－1／Km
1／CS
图2－2 双倒数法求解Km和rmax
习题
• 将底物1 g/L和酶0.001 mol/L加入到酶反应器中，经反应，底物转化率为90% 时，反应时间是多少？已知反应速率方程为
• 第二章 微生物反应动力学(6)
•
• 第三章 微生物反应器操作(5)
• • • •
• 第四章 动植物细胞培养动力学(2)
• 动植物细胞培养的特性，植物细胞培养及反应动力学，动物细胞培养及反 应动力学
• 第五章 生物反应器中的传质过程(4)
• 流体流变学特性, 发酵液的流变学特性, 氧传递理论，体积溶氧系数的测定, 影响kLa的因素及其提高措施
• 引言：碱性果胶酸裂解酶活力测定 • 取适量稀释一定倍数的粗酶液和2 ml 1% (w/w)果胶溶液(pH 9.6) 分别置于两个试管中，于55℃水浴预热5 min，然后吸取1 ml粗 酶液加入到果胶溶液中，并使它们充分混匀，准确反应10 min。 取上述反应混合物1 ml 加入9 ml 0.01 mol/l HCl终止反应，在235 nm处测定吸光值，以灭过酶活的酶液作为空白对照。 • 一个标准酶活单位定义为：每分钟使果胶裂解产生1μmol的不饱 和聚半乳糖醛酸所需的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的 摩尔吸光系数为4600Lmol-1cm-1[6]。 • U =（A/4600）×106×10-3×3×10×（1/10）×n • = A×n×(30/46) • 式中：U-----------酶液的酶活力， U/mL • A —————OD值 • n ———— 酶液稀释倍数
非竞争性抑制
1／ r
CI
CI = 0
1／rmax
1／rmax’
1／rmax
-1／Km -1／Km’
1／CS
-1／Km
1 ／ CS
产物抑制：酶促反应中，有时随产物浓度提 高，产物与酶形成复合物，阻碍了底物与酶 的结合，从而降低了酶促反应的速度。
反应机理：
快速平衡法推导动力学方程:
解之,得
式中:
稳态法推导动力学方程:
• 第六章 生物反应器(3)
• 生物反应器设计基础，常见的生物反应器, 生物反应器放大的目的与方法
• 第七章 生物反应工程领域的拓展(6)
• 超临界生物反应，双液相生物反应、代谢工程、系统生物学等生物应工程 领域的拓展介绍
• 引言：碱性果胶酸裂解酶活力测定 • 取适量稀释一定倍数的粗酶液和2 ml 1% (w/w)果胶溶液(pH 9.6) 分别置于两个试管中，于55℃水浴预热5 min，然后吸取1 ml粗 酶液加入到果胶溶液中，并使它们充分混匀，准确反应10 min。 取上述反应混合物1 ml 加入9 ml 0.01 mol/l HCl终止反应，在235 nm处测定吸光值，以灭过酶活的酶液作为空白对照。 • 一个标准酶活单位定义为：每分钟使果胶裂解产生1μmol的不饱 和聚半乳糖醛酸所需的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的 摩尔吸光系数为4600Lmol-1cm-1。 • U =（A/4600）×106×10-3×3×10×（1/10）×n • = A×n×(30/46) • 式中：U-----------酶液的酶活力， U/mL • A —————OD值 • n ———— 酶液稀释倍数
快速平衡法推导动力学方程： 几点假设： （1）CS>>CE，中间复合物ES的形成不 会降低CS。 （2）不考虑产物P的可逆反应。 （ 3） 为快速平衡， 为整个反应的限速阶段，因此ES分解 成产物不足以破坏这个平衡。
根据假设建立动力学方程
解之，得
令 则
稳态法推导动力学方程： 几点假设： （1）CS>>CE，中间复合物ES的形成不会降 低CS。 （2）不考虑这个可逆反应。 （3）CS>>CE中间复合物ES一经分解，产生 的游离酶立即与底物结合，使中间复合物 ES浓度保持衡定，即 。
的物理意义是表面反应速率与内扩散速率之 比。对各类反应动力学与固定化酶的形状，普遍 化的的定义式为 :
引入无因次参数，则
无解析解，只有数值解。
见教材33页图2-10
内扩散效率因子in 是 和的函数。 对in影响不大，影响in的主要参数是 西勒准数。如果 ，则 不随 变化，近似等于1，也就是说没有内部 传质阻力，若 ，则 ，反 应为内扩散所限制。
为提高固定化酶内扩散效率，应 设法减小。 减小的措施主要是适当降低固定 化酶颗粒粒径。
外扩散过程
Da准数是决定外扩散 效率的唯一参数。 Da准数定义： 外扩散效率因子定义：
内扩散过程
准数是决定内扩散效 率的主要参数。 西勒准数定义： 内扩散效率因子定义：
Da<<1，过程为反应控制； <<0.3时，过程为反应控制； Da>>1，过程为外扩散控制 >>0.3时，过程为内扩散控制。
根据以上假设，可建立如下方程组
解之，得
令 则
米氏方程 r
rmax
rmax/2
Km
CS
图2－1 酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响
对米氏方程的讨论：
• 当CS<<Km时，
，属一级反应。 ，属零级反应。
• 当CS>>Km时，
• 当CS＝Km时，
。Km在数量上等
于反应速度达到最大反应速度一半时的 底物浓度。
2.3.2.2 内部扩散过程
具有大量内孔的球形固定化酶颗粒 dr r
内扩散效率因子
R
稳定状态下，对底物进行物料衡算：
流入量－流出量＝反应量
整理,得
两侧同除
,得
当反应符合米氏方程规律时，
故, 令 , ,
, 上式可转化为无因次形式，得
边界条件:
, ,
该微分方程无解析解，只能用数值法求解。
西勒准数( )
竞争性抑制反应机理：
快速平衡法推导动力学方程：
解之，得
，
式中:
采用稳态法推导动力学方程：
解之，得
式中:
非竞争性抑制反应机理
快速平衡法推导动力学方程
解之，得
式中:
稳态法推导动力学方程：
解之，得
式中:
竞争性抑制
非竞争性抑制
令 可变形为:
令 可变形为:
竞争性抑制
1／r
CI CI = 0
• 分子构象的改变
• 位阻效应 • 微扰效应 • 分配效应 • 扩散效应 （可用Kp 定量描述）链接 （可定量描述）
分配系数 (Kp)链接
分配系数：载体内外底物(或其他物质)浓度之比。
Kp的测定： 已知底物浓度(CS0 )，体积(V0)的溶液中， 放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当 达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度(Cs)。
简单机制
＋A ＋B －Q －P
E
－A
EA
－B
EAB
EPQ
＋Q
EP
＋P
E
双底物酶促反应动力学
反应机理：
解之，得
式中：
2.3 固定化酶促反应动力学
2.3.1 固定化酶促反应动力学基础 2.3.1.1 酶的固定化技术定义 酶的固定化技术是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电 吸附，共价键等与载体如角叉菜胶、离子交换树脂等材料制成固 相酶的技术。 细胞的固定化技术: 为省去从微生物（或动、植物）中提取 酶的操作，确保酶的稳定性，采用直接固定化微生物细胞、动植 物细胞、组织技术。
第一章
酶促反应动力学
魏春
课程主要内容
• 第一章 酶促反应动力学(4)
• 酶促反应动力学特点；酶促反应动力学基础；米氏方程；竞争性抑制酶促反应 动力学；非竞争性抑制酶促反应动力学；产物抑制酶促反应动力学；底物抑制 酶促反应动力学；多底物酶促反应动力学；酶的失活动力学 影响微生物生长和代谢的各种因素, 微生物反应过程计量学, 得率系数，比生 长速率概念及计算, 微生物生长的非结构模型，基质消耗动力学,产物合成动力 学 微生物反应器操作的分类及比较 分批式操作：生长曲线及状态方程式 流加式操作：流加操作的分类、指数流加数学模型 连续式操作：连续操作存在的问题及应用
2.3.2 固定化酶促反应过程分析
2.3.2.1 外部扩散过程 以表面固定化酶为例。
CSS
CS
外扩散过程分析 外扩散速率：
酶促反应速率： 达到平衡时，
即
N, r
rmax
Nmax
N，r Nmax
(CSS，rout)
0 CSS CS
(CSS，rout)
rmax
0 CSS CS
Da准数 :
当 时， 过程为外扩散控制。 当 时， 过程为反应控制。