膜片钳与离子系统技术平台的标准操作规程

膜片钳与离子系统技术平台的标准操作规程
关键词：膜片钳，离子成像
目的：本操作规程是关于利用膜片钳与离子成像系统技术平台进行细胞内离子研究的具体操作规程。

仪器负责人：杨琳
操作步骤：
一、膜片钳系统
（一）Sutter P-97拉制仪
1、开左侧电源开关，预热10min。

2、运行RAMP TEST坡度测试，确定玻璃管的加热值，使加热能够熔化玻璃但又不至于烧
断加热片。

警告：第一次使用拉制仪或更换加热丝、更换不同型号的玻璃时，都应该作RAMP TEST 坡度测试，然后把RAMP TEST的值当做新编辑的程序的HEAT值。

下面是运行RAMP TEST的步骤：
（1）进入任一程序（按0-9 Enter回车）。

（2）按清除键<CLR>进入控制功能。

（3）按<0>不要清除参数数值。

（4）按<1>即能运行RAMP TEST 坡度测试。

（5）安装玻璃管和按<PULL>。

（6）记录RAMP TEST值，将用于设置HEAT。

3、做完RAMP TEST后记下它的值按RESET。

选择一个程序，按光标提示输入测试得到的
HEA T值，调整PULL、VELOCITY、TIME等参数值，设置拉制步数（Cycle）。

4、安装玻璃管：先将玻璃管安放在一侧的玻璃管夹的槽内，用旋钮固定，然后将玻璃管推
过加热小室，用另一侧的玻璃管夹固定。

5、按“PULL”键，拉制电极
6、小心取下拉制好的微电极。

7、关闭电源。

注意：
1．不能用力按压玻璃管夹！将玻璃管推入加热小室时不能碰到加热丝！
2．用户要根据自己的需要先通过RAMP TEST确定HEAT值，再不断调整PULL、VELOCITY、TIME值，使之做一步二步甚至多步拉制达到自己的应用目的。

3．前后面板（按钮、开关、旋钮）控制的功能及作用
（1）前面板
LCD Display：显示程序参数
Reset：初始化复位控制
Air Pressure：在拉制周期的有效制冷状态期间设置空气压力的值
Keypad：用于设置程序参数值和执行程序
0~9：用于选择所要的程序或控制功能，当程序设计时输入数字值和作决定是/否（Yes/No）（1/0）
CLR：进入某个程序后本键用于删除程序或数值，也用于作坡度测试（RAMP TEST）的入口
ENTER：回车，确定新数值或程序
NEXT：编辑时移动到程序的下一行
LAST：编辑时移动到程序的上一行
PULL：开始执行程序
STOP：终止执行程序
LCD Display显示：
Program (0-9)：一个程序由一行（Cycle）或多行组成（一个Cycle包括4个程序参数：HEAT、PULL、VELOCITY、TIME，一个Cycle相当于一行程序代码）。

当执行拉制一支嵌入仪器的毛细玻璃管时，一个程序能连续拉16Cycles长度。

HEAT：HEAT是控制一个供给加热片的电流水平，设置加热片的功能，使之能熔化特定的玻璃管（组成物质及大小），在操作部分讨论坡度测试的相对值很重要，它就是你所要的加热（HEAT）值。

PULL：控制强加给的拉力，一般较高的PULL值会产生较小的和较长的锥形尖端。

VELOCITY：拉制杆移动速度达到一定程度，拉断电极。

TIME：TIME控制有效的制冷空气时间长度。

（2）后面板
电压转换器，国内使用220V，应使Δ对准220V。

电源接口及保险丝（电源开关在左侧面）。

（二）微操纵器操作规程
SUTTER公司MP-285微操纵器由三部分组成：Controller控制器、Rotary Optical Encode（ROE）和用于固定电极的Manipulator。

1、MP285 Controller控制器。

（1）0-9 选择精度，编辑程序数据。

（2）MOV 开始移动。

（3）PRGM 编辑程序。

（4）TAB 切换数据，程序。

（5）ENTER 确认程序。

（6）ESC 退到主菜单。

（7）“＊“ 进入菜单。

2、Rotary Optical Encode（ROE）。

（1）Home 按下灯亮，电极会回到预先设定的”Home”位置。

（2）NORM/DIAG：从正常移动模式转换为第四轴模式.
（3）COARSE/FINE：在1，2，3，4四种精度中进一步分为粗细调节。

（4）CONT/PULSE：连续模式转换为步进模式。

3、Manipulator
（1）可大幅度的旋出探头，方便更换电极。

（2）可确定探头的倾角。

（3）可提高和降低探头固定臂。

操作：
（1）打开MP285 Controller前面板的电源
（2）拧开Manipulator部分固定探头的螺丝，转出探头，装上电极
（3）在MP285 Controller的主菜单按1（快进模式），按ENTER
（4）按MOV（MP285 Controller）
（5）转动ROE三个转盘推进电极
（6）接近细胞后按ROE上的COARSE/FINE按钮，灯亮后以FINE模式推进电极，进行封接。

（7）完成后，撤掉电极，使Manipulator回到初始状态。

（三）Digidata 1322A
打开后面板的电源按钮，前面板绿灯和黄灯亮后即可正常运行。

（四）膜片钳放大器
1、打开MutiClamp 700A的电源开关，通过双击电脑桌面的快捷图标运行MultiClamp Commander。

点击主界面的Channel 1 Mode，选择Voltage Clamp或Current Clamp模式，同时MultiClamp 700A控制面板正面相应的Voltage Clamp或Current Clamp指示灯会闪烁。

2、参数设置
Commander程序面板窗口中，先用按钮Reset to Program Defaults使所有参数恢复到默认值，然后在Options中进行如下设置：
（1）General
a）Sync Output中可根据需要选择Internal command或mode。

b）LowpassFilter Type中全部选Bessel。

滤波频率可在Commander程序面板窗口中设定，其默认值为10 kHz，根据噪声情况，一般全细胞记录可采用2～5 kHz，单通道选5～10 kHz。

c）Gains
根据所记录电流的最大幅度选择反馈电阻，一般全细胞记录最大电流幅度在几十nA水平，故默认值为500 MΩ。

单通道最大电流幅度在几百pA水平，可选5或50G Ω。

其余不作改动。

d）Auto
如果不使用钳制模式的自动转换功能，此部分无需作改动。

另外，在进行串联电阻补偿时，出现振荡的解决方法也可选择降低补偿程度（选第二项）。

设置完成后可保存为*.mcc文件，还可进一步采用Quick Select功能将该文件赋予给工具栏按钮，这样下次实验时可直接调用。

上述设置的钳制模式为电压钳模式。

2、准备封接
（1）打开Clampex的Seal Test，设定封接测试脉冲电流方波的幅度与频率。

（2）在玻璃微电极内维持一定的正压，降低电极入液，在Seal Test中可见测试脉冲方波。

观察电极电阻的大小。

（3）用Auto调节Pipette Offset，使I（pA）＝0。

3、封接
（1）使电极逐渐接触细胞。

当电阻突然增大，电流降低1/3以上时，去除正压并轻轻给予负压吸吮以形成稳定封接。

封接形成后，封接测试脉冲消失，仅出现电极电容瞬变值。

（2）观察封接电阻的大小，一般膜片钳记录要求封接电阻在1 GΩ以上。

（3）补偿电极电容：用Cp Fast和Cp Slow对电极电容进行补偿。

（4）漏电流（封接电流）的去除：单通道记录可选Leak Subtraction功能。

建议采用Clampex 的P/N Leak Subtraction功能。

（5）经过上述步骤就形成了细胞贴附式单通道记录模式。

如要形成内面向外式，还需将膜片撕下。

如要形成外面向外式或全细胞记录，还需打破细胞膜。

4、破膜
（1）继续给予负压吸吮或用Zap功能电击打破细胞膜。

（2）破膜后，缓慢撤除电极内的负压。

（3）进行膜电容补偿：选上Whole Cell，用Auto对膜电容进行补偿，必要时用手工进行细微调节。

（4）进行串联电阻补偿：选上RsCompensation和Disable if oscillation detected（或Reduce if oscillation detected），增大Prediction和Compensation对串联电阻进行补偿。

注：若要形成外面向外记录模式，可在步骤（2）后，缓慢地上提玻璃微电极，封接处附近的细胞膜会从细胞上脱离下来并自动融合。

此时不用执行步骤（3）和（4）。

5、记录
关闭Seal Test。

选择设定好的Clampex采样软件的Protocol，开始记录细胞电信号。

注意：（1）如果记录的基线不在零，可选Output Zero，用Auto对基线归零。

（2）如果噪声过大，可降低滤波频率。

（3）漏减功能最好选择Clampex中的P/N Leak Subtraction功能。

（4）细胞膜钳制电位也要使用Clamprx中设定的钳制电位。

（5）若单通道的电流幅度较小，可通过增大Gain获得满意的窗口显示。

注意：
1、充灌微电极时，只要电极内液液面能够和银丝相接触即可，过多的电极内液可能会溢出
污染电极夹持器，还会增大导电半径，从而增大记录噪声。

充灌完成后，用滤纸吸干残留在电极尾端的电极内液。

2、静电排除：冬季因气候干燥容易产生静电，为防止手上带静电，应先触摸接地的金属物
体（如屏蔽网或显微镜），然后再触摸放大器探头。

3、使用显微镜时注意保护物镜镜头，避免刮伤。

二、离子成像系统
1、开机
（1）打开polychrome系统
打开控制单元后面的主电源，此时位于控制单元前面左侧的power组件上标记为main 的灯应亮起绿色。

然后按标记为lamp的黑色按钮点亮氙灯，几秒钟后相应的灯应亮起绿色。

短暂延迟之后control灯亮起。

如果氙灯在上次使用后仍未冷却，请不要马上点亮。

注意：
如果你想重新点亮氙灯，请先按control按钮关闭电路，避免电流冲击对电路元件造成损坏。

关闭氙灯将会自动关闭控制单元。

如果你想使用控制单元而关闭氙灯，则只需按control 按钮即可。

这样也可以使单色光发生器的风扇继续运转，有助于降温。

氙灯通常需要预热15 min左右。

（2）打开Imaging系统
打开polychrome系统后，启动计算机。

按下相机后部的按钮启动相机。

此时control 灯应红/绿交替闪烁，等IMAGO达到它的运行温度后灯将持续亮绿色。

2、动TILLvisION软件
（1）双击桌面图标运行TILLvisION软件，出现软件主界面的同时将会同时显现一个workspace模版，可以通过对模版中流程参数的修改建立新的workspace。

（2）图象获得主要通过以下两种途径
●使用Grab Settings对话框。

点击工具栏中的，打开Camera页，可以看到live
或snapshot两种图片获得方式。

图片类型分为投射、红外和荧光三种，还可以分
别设定曝光时间、循环次数和象素。

●通过使用TILL Protocol Editor更加灵活的获得图片。

3、the Protocol Editor
通过Protocol Editor可以建立合适的实验流程，每个流程需要至少三方面的定义：
●获取图片的大小（相机设置）
●获取图片数量
●获取图片类型（类型包括投射、特定波长的荧光，曝光时间）
在编辑时，Protocol Editor会注意设置的数学和逻辑上的正确性。

设定完后流程可以保
存在workspace中和单独保存为流程文件。

a)确立流程
有多种途径用于新建、导入和重新编辑流程，可以选择你适合的方法。

i.建立编辑一个新流程，并把它保存为一个独立的文件
ii.建立编辑一个新流程，并把它粘贴到一个打开的workspace中
iii.将一个新流程导入打开的workspace中并编辑它
iv.重新编辑一个已经导入的流程
v.导入并重新编辑一个已经存在的流程
b)通过Protocol Command对流程进行编辑
c)运行流程：选择一个流程，点击工具栏中的键运行流程。

d)运行结束之后，相应图片可以在workspace中找到，其名称为自动生成。

4、钙离子成像实验
单细胞内钙离子浓度检测实验可以分三步进行：实验计划确定→调整设置→重复实验。

开机：分别打开Polychrome、计算机、相机和其余设备，让机器预热。

同时运行TILLvisION 软件。

a)建立实验计划，设计合适的实验流程，主要参数包括：相机设置、循环设置、图片获
取设定、在线分析设定。

b)将孵育好的细胞置于显微镜下。

先用显微镜观察细胞，将所要监测的细胞置于视野最
中央，然后将显微镜打到SP状态，在荧光模式下使用Grab Settings获取图片，注意检测Furo-2滤光片已选定，相机的光路是开通的。

c)检查通过Snapshot获取的图片，查看强度参数是否合适。

就强度而言，需要考虑：整
体强度，饱和度，动态范围。

图片强度不能超过4095。

注意：当图片背景为红或白色时，说明相机CCD饱和，需要关闭投射光，或缩短曝光时间；当背景为灰或绿色时，说明样品颜色偏浅，需要延长曝光时间。

d)调节流程参数。

分别有两种流程：Standard Protocol和Optimized Protocol，可以根据
实际需要进行选择。

在参数调节上以如下顺序进行：binning factor（仅供优化实验选择），chip window size（仅供优化实验选择），number of cycles（循环次数），cycle time （循环时间），exposure times of acquisitions（曝光时间），scaling of online image display （在线图象排列方式），selection of ROIs for kinetic calculation（选择感兴趣区域进行
动态计算），scaling of online kinetic（在线动力学方式）。

e)运行流程：确定流程后，点击工具栏中的键运行流程。

f)分析数据
细胞内Ca2+荧光强度变化图像由随机软件TILLvisION Imaging Software进行分析处理，得到细胞内Ca2+变化（相对荧光强度值）的时间-效应曲线，再转换为时间-[Ca2+]i曲线。