膜片钳与离子系统技术平台的标准操作规程

膜片钳与离子系统技术平台的标准操作规程

关键词：膜片钳，离子成像

目的：本操作规程是关于利用膜片钳与离子成像系统技术平台进行细胞内离子研究的具体操作规程。

仪器负责人：杨琳

操作步骤：

一、膜片钳系统

（一）Sutter P-97拉制仪

1、开左侧电源开关，预热10min。

2、运行RAMP TEST坡度测试，确定玻璃管的加热值，使加热能够熔化玻璃但又不至于烧

断加热片。

警告：第一次使用拉制仪或更换加热丝、更换不同型号的玻璃时，都应该作RAMP TEST 坡度测试，然后把RAMP TEST的值当做新编辑的程序的HEAT值。

下面是运行RAMP TEST的步骤：

（1）进入任一程序（按0-9 Enter回车）。

（2）按清除键进入控制功能。

（3）按<0>不要清除参数数值。

（4）按<1>即能运行RAMP TEST 坡度测试。

（5）安装玻璃管和按。

（6）记录RAMP TEST值，将用于设置HEAT。

3、做完RAMP TEST后记下它的值按RESET。选择一个程序，按光标提示输入测试得到的

HEA T值，调整PULL、VELOCITY、TIME等参数值，设置拉制步数（Cycle）。

4、安装玻璃管：先将玻璃管安放在一侧的玻璃管夹的槽内，用旋钮固定，然后将玻璃管推

过加热小室，用另一侧的玻璃管夹固定。

5、按“PULL”键，拉制电极

6、小心取下拉制好的微电极。

7、关闭电源。

注意：

1．不能用力按压玻璃管夹！将玻璃管推入加热小室时不能碰到加热丝！

2．用户要根据自己的需要先通过RAMP TEST确定HEAT值，再不断调整PULL、VELOCITY、TIME值，使之做一步二步甚至多步拉制达到自己的应用目的。

3．前后面板（按钮、开关、旋钮）控制的功能及作用

（1）前面板

LCD Display：显示程序参数

Reset：初始化复位控制

Air Pressure：在拉制周期的有效制冷状态期间设置空气压力的值

Keypad：用于设置程序参数值和执行程序

0~9：用于选择所要的程序或控制功能，当程序设计时输入数字值和作决定是/否（Yes/No）（1/0）

CLR：进入某个程序后本键用于删除程序或数值，也用于作坡度测试（RAMP TEST）的入口

ENTER：回车，确定新数值或程序

NEXT：编辑时移动到程序的下一行

LAST：编辑时移动到程序的上一行

PULL：开始执行程序

STOP：终止执行程序

LCD Display显示：

Program (0-9)：一个程序由一行（Cycle）或多行组成（一个Cycle包括4个程序参数：HEAT、PULL、VELOCITY、TIME，一个Cycle相当于一行程序代码）。当执行拉制一支嵌入仪器的毛细玻璃管时，一个程序能连续拉16Cycles长度。

HEAT：HEAT是控制一个供给加热片的电流水平，设置加热片的功能，使之能熔化特定的玻璃管（组成物质及大小），在操作部分讨论坡度测试的相对值很重要，它就是你所要的加热（HEAT）值。

PULL：控制强加给的拉力，一般较高的PULL值会产生较小的和较长的锥形尖端。

VELOCITY：拉制杆移动速度达到一定程度，拉断电极。

TIME：TIME控制有效的制冷空气时间长度。

（2）后面板

电压转换器，国内使用220V，应使Δ对准220V。

电源接口及保险丝（电源开关在左侧面）。

（二）微操纵器操作规程

SUTTER公司MP-285微操纵器由三部分组成：Controller控制器、Rotary Optical Encode（ROE）和用于固定电极的Manipulator。

1、MP285 Controller控制器。

（1）0-9 选择精度，编辑程序数据。

（2）MOV 开始移动。

（3）PRGM 编辑程序。

（4）TAB 切换数据，程序。

（5）ENTER 确认程序。

（6）ESC 退到主菜单。

（7）“＊“ 进入菜单。

2、Rotary Optical Encode（ROE）。

（1）Home 按下灯亮，电极会回到预先设定的”Home”位置。

（2）NORM/DIAG：从正常移动模式转换为第四轴模式.

（3）COARSE/FINE：在1，2，3，4四种精度中进一步分为粗细调节。

（4）CONT/PULSE：连续模式转换为步进模式。

3、Manipulator

（1）可大幅度的旋出探头，方便更换电极。

（2）可确定探头的倾角。

（3）可提高和降低探头固定臂。

操作：

（1）打开MP285 Controller前面板的电源

（2）拧开Manipulator部分固定探头的螺丝，转出探头，装上电极

（3）在MP285 Controller的主菜单按1（快进模式），按ENTER

（4）按MOV（MP285 Controller）

（5）转动ROE三个转盘推进电极

（6）接近细胞后按ROE上的COARSE/FINE按钮，灯亮后以FINE模式推进电极，进行封接。

（7）完成后，撤掉电极，使Manipulator回到初始状态。

（三）Digidata 1322A

打开后面板的电源按钮，前面板绿灯和黄灯亮后即可正常运行。

（四）膜片钳放大器

1、打开MutiClamp 700A的电源开关，通过双击电脑桌面的快捷图标运行MultiClamp Commander。点击主界面的Channel 1 Mode，选择Voltage Clamp或Current Clamp模式，同时MultiClamp 700A控制面板正面相应的Voltage Clamp或Current Clamp指示灯会闪烁。

2、参数设置

Commander程序面板窗口中，先用按钮Reset to Program Defaults使所有参数恢复到默认值，然后在Options中进行如下设置：

（1）General

a）Sync Output中可根据需要选择Internal command或mode。

b）LowpassFilter Type中全部选Bessel。滤波频率可在Commander程序面板窗口中设定，其默认值为10 kHz，根据噪声情况，一般全细胞记录可采用2～5 kHz，单通道选5～10 kHz。c）Gains

根据所记录电流的最大幅度选择反馈电阻，一般全细胞记录最大电流幅度在几十nA水平，故默认值为500 MΩ。单通道最大电流幅度在几百pA水平，可选5或50G Ω。其余不作改动。

d）Auto

如果不使用钳制模式的自动转换功能，此部分无需作改动。另外，在进行串联电阻补偿时，出现振荡的解决方法也可选择降低补偿程度（选第二项）。

设置完成后可保存为*.mcc文件，还可进一步采用Quick Select功能将该文件赋予给工具栏按钮，这样下次实验时可直接调用。上述设置的钳制模式为电压钳模式。

2、准备封接

（1）打开Clampex的Seal Test，设定封接测试脉冲电流方波的幅度与频率。

（2）在玻璃微电极内维持一定的正压，降低电极入液，在Seal Test中可见测试脉冲方波。观察电极电阻的大小。

（3）用Auto调节Pipette Offset，使I（pA）＝0。

3、封接

（1）使电极逐渐接触细胞。当电阻突然增大，电流降低1/3以上时，去除正压并轻轻给予负压吸吮以形成稳定封接。封接形成后，封接测试脉冲消失，仅出现电极电容瞬变值。

（2）观察封接电阻的大小，一般膜片钳记录要求封接电阻在1 GΩ以上。