DNA序列测定与比对

一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的 ddNTP(终止子)
unlabeled primer
AmpliTaq FS dATP, dCTP, dGTP, dTTP
ddCTP
+
ddATP
template DNA
测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行 纯化，除去过量的ddNTP后上样。
ddGTP ddTTP
循环测序法：
与PCR原理相结合，反复进行“热变性—引物退火—DNA延 伸”等步骤
2、DNA自动测序
采用荧光（四甲基若丹明，Tetramethylrhodamine）替 代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用 不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序 反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后， 通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发 射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确 定DNA碱基的排列顺序。
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddTTP
反应结束后， 将4管反应液混 合，经乙醇沉淀 后上样
DNA自动测序结果举例
第三节 DNA序列的同源比对
1、数据库资源 • Genbank (www.NCBI.nlm.nih.gov) • 来自百度文库MBL (www.ebi.ac.nk) • DDBJ (www.ddbj.ac.jp)
一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标 记有不同颜色的荧光。
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddATP (terminator)
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddCTP
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddGTP
注意：
1、胶放射自显影后读序 列 ，变 性序列 胶浓 度 20 ％左右PAGE 2、胶上读出序列为测序 链的3’→5’方向 3、引物标记
ddC ddT ddA ddG
3’------------5’
AACGGTACAC AACGGTACA AACGGTAC AACGGTA AACGGT AACGG AACG AAC AA A
DNA的测序仪示意图
computer analysis
样品槽
成象透镜 聚焦透镜
高灵敏度相机 旋光镜/棱镜组件
凝胶中DNA移动方向
输入光学系统 激光器
同位素标记到荧光标记，平板电泳到毛细管电泳
同位素标记 平板电泳
ACG T
单色荧光标记 平板电泳
ACG T
多色荧光标记 毛细管电泳
测序图谱
T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T
gi|315667010|gb|HQ423157.1|
2、Blast——核酸、蛋白序列比对工具
Blast——basic local alignment search tool，局部对比 基本检索工具，将核酸序列或蛋白质序列与可用的 序列数据库进行相似性比对的一系列程序。寻找序 列间的相似性区段，进而比较之间的结构与功能。
2、各种BLAST介绍
（1）Nucleotide BLAST ① Standard nucleotide-nucleotide BLAST
• 以三种格式（fasta格式，Genbank Accession编码 或者GI编码）
• GI编号：NCBI网站的所有序列相关数据库的流 水编号,其最有用的特征就是唯一性
• Genbank Accession：Genbank登录号
fasta格式：
>A2clone16srDNA, uncultured bacterium clone A2
第十七章 DNA序列测定及比对
第一节 测序原理
1、 Sanger的双脱氧链终止法 • Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定
单链DNA的序列。 • 其基本原理如下：
① DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA 互补链；
② 该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合 到 新 生 寡 核 苷 酸 链 的 3'- 末 端 ， 从 而 终 止 其 延 伸 反 应 。 在 DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如 T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一 种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。
TTaCCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATGAATCACACCGTGGTAACCGTCCTCCCGAGGGT TAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCC CGGGAACGTATTCACCGTGACATTCTGATTCACGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGT CGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCT TGGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGAT GACTTGACGTCATCTCCACCTTCCTCCTGGTTAACCCAGGCAGTCTCGCTAGAGTGCTCAAC TTAATGGTAGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACG ACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCTATCT CTAGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCA CATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTAC TCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAC