生物制药工艺学 灭菌技术及微生物发酵的操作方式

连续培养的优缺点
优点: 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。 发酵周期长，产量高。
❖ 解决办法：装设旁通（小放气阀）
排气管的死角
压力表安装不合理形成的死角
分批培养（batch culture or
fermentation）
分批培养是指在一个密闭系统内投入有限数量的营 养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，在特定 的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法蒸。汽
空气
发酵尾气 消泡剂 酸碱
❖ 灭菌：指利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及 设备中一切生命物质的过程。
❖ 消毒：是指用物理或化学的方法杀死物料、设备、 器具内外的病源微生物, 一般只能杀死营养细胞而不 能杀死芽孢。
消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。
注意：
❖在工业生产中, 为了保证纯 种培养, 在生产菌种接种之 前, 要对培养基、消泡剂、 流加物料、空气系统、设备、 管道等进行灭菌, 还要对生 产环境进行消毒, 防止杂菌 和噬菌体的大量繁殖。
❖ 使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌。对固 体物料灭菌不彻底, 也不能用于液体物料的灭菌。
过滤介质除菌法
❖ 原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。 ❖方法： 0.01-0.45um孔径滤膜 ❖ 使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热
化合物溶液除菌。工业上常用过滤法大量制备无 菌空气, 供好氧微生物 培养过程使用。
但加热和冷却时间较长，营养 成分有一定的损失，罐利用率低 ，不能采用高温快速灭菌工艺
150
过程包括：升温、保 温度 温和冷却等三个阶段。 100
各阶段对灭菌的贡献： 50 20%、75%、5%
0
保温 升温
冷却
80 120 160
240
时间（min)
各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%
从以上分析可知，灭菌过程中加热和保温阶段 的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次 要的，一般很小，可以忽略不计。
干热灭菌（包括火焰灭菌、烘箱灭菌）
❖ 原理：利用高温对微生物有氧化作用，蛋白质变 性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。
❖常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180℃ 12小时。
❖使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌 。
湿热灭菌
❖ 包括巴氏灭菌、间歇灭菌、高压蒸汽灭菌 ❖ 原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且
5. 发酵设备利用率高
1.对设备的要求高，需另外设置加热、 冷却装置 2. 操作较麻烦 3. 染菌的机会较多 4. 不适合于含大量固体物料的灭菌 5 对蒸汽的要求高
1.设备要求低，不需另外设置加 热、冷却装置
2. 操作要求低，适于手动操作
3. 适合于小批量生产规模
4.适合于含有大量固体物质的培 养基的灭菌
生物制药工艺学
问题： 在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？
杂菌污染的后果：
❖ 1、由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌 的消耗而损失，造成生产能力的下降；
❖ 2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了 培养液的某些理化性质，使产物的提取和分离变得困难， 造成收率降低或使产品的质量下降；
处理方法：发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉，严防发酵液 任意流失；全部停产，对环境进行全面的清洗和消毒，断 绝噬菌体的寄生基础；更换生产菌种，筛选抗噬菌体的菌 种，防止重复污染。
防止染菌的措施
设备方面：要求发酵罐及其附属设备应做到无渗漏， 无死角。凡与物料、空气、下水道连接的管件都应保证 严密不漏，蛇形管和夹套应定期试漏。 空气净化系统方面：提高空气进口的空气洁净度，除尽 压缩空气中夹带的油和水，保持过滤介质的除菌效率。 定期检查更换空气过滤器过滤介质，使用过程中要经常 排放油水。 工艺方面：放罐后要进行全面检查清洗。（清理罐内残
工业中常用的灭菌方法
❖ 化学物质灭菌 ❖ 辐射灭菌 ❖ 过滤介质灭菌 ❖ 热灭菌，包括干热灭菌和湿热灭菌
化学试剂灭菌法
❖ 原理：某些化学药剂能与与微生物细胞中的成分 反应，使蛋白质变性、酶失活。
❖ 常用的灭菌剂：新洁尔灭（苯扎溴铵）、杜灭芬、 高锰酸钾、漂白粉、酒精、甲醛、戊二醛、过氧 乙酸等。
❖ (2) pH 值 pH 值对微生物的耐热性影响很大。pH 值 6.0～ 8.0, 微生物最耐热；pH<6.0，氢离子易渗入微生物细胞内, 从而改变细胞的生理反应促使其死亡。所以培养基 pH 值愈 低, 灭菌所需的时间愈短。
❖ (3) 培养基中的颗粒 培养基中的颗粒小, 灭菌容易, 颗 粒大, 灭菌难。一般含有小于1mm 的颗粒对培养基灭菌 影响不大, 但颗粒大时, 影响灭菌效果, 应过滤除去。
或浑浊。 2.双碟上连续3个时间样品长出杂菌 3.检查样品保留，以备长期监测。一般12小时
后。
染菌的处理 （一）污染杂菌的处理 1.种子罐的处理 2.发酵罐的处理 3.染菌后设备的处理
（二）污染噬箘体的处理 噬菌体污染后发酵液转稀，泡沫增多，早期镜检发现菌
体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶，最后仅残留 菌丝片段，平皿中出现典型的噬菌斑，营养成分很少消耗 ，产物合成停止。
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连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的 料液预热到60-70，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差 过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使 高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌 温度（126-132）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠 这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下 保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来 的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却， 冷却到40-50后，输送到预先已经灭菌过的罐内。
特点：
(1)整个培养系统与外界没有其它物质交 换（O2、CO2、消泡剂、酸碱除外）
(2)整个过程中菌的浓度、营养成分的浓 度和产物浓度不断变化，是一种非稳态 的培养方法。
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菌 数 的 对 数
分批培养过程中典型的细菌生 长曲线
问题
为什么说微生物分批培养 是一种非稳态的过程？
a
b
0
c 时间
d
16
在分批培养过程中，随着微生长细胞和底物、代谢物的浓度等的不 断变化，微生物垢生长可分为停滞期、对数生长期、稳定期和死亡期等 四个阶段。
❖ 3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的pH值，从而使生 物反应发生异常变化；
❖ 4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败； ❖ 5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，
等等
如何实现纯种培养
❖设备无死角，没有构成染菌可能的因素 ❖对生产环境和培养基进行严格的消毒和灭菌 ❖好氧发酵过程应通入无菌空气。
优点：无需专一灭菌设备，但易发生局部过热而 破坏营养成分的现象。
适用条件：当培养基中含有固体颗粒或培养基有 较多泡沫时，以采用分批灭菌为好。对于容积 小的发酵罐，连续灭菌的优点不明显，而采用 分批灭菌比较方便。
（二）连续灭菌
培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌， 冷却后送入已灭菌的发酵罐的工艺过程。 特点：
在高温有水分条件下，蛋白质易变性而使微生物 死亡。 ❖常用方法：水煮常压灭菌 100℃
饱和蒸汽灭菌 一般121℃ 30min ❖ 使用范围：培养基和发酵设备灭菌。
灭菌方法连 线题
接种针、试管口 环境空气、皮肤表面
无菌室、接种箱 培养基的灭菌 空气
过滤除菌法 火焰灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学试剂灭菌法
1.迅速，损失少。 2.发酵罐非生产占用时间少，容积利用率高。 3.自动化，热能利用率合理。 4.不适用于粘度大和固形物含量高的培养基。
连续灭菌过程
A 喷淋冷却式 B 真空冷却式 C 薄板冷却式
预热——加热（126-132℃）——维持——冷却
培养基升 温到70 ℃
A 塔式加热器 B 喷射式加热器
A 罐式保温设备 B 管式保温设备
❖ 使用范围：器皿、双手以及实验室、无菌室的环 境灭菌，不能用于培养基灭菌。
辐射灭菌法
❖ 原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化 学反应造成菌体死亡。
❖常 用 ： 紫 外 线 、 X 射 线 和 γ 射 线 。 （ 波 长 在 260nm左右的紫外线灭菌效果最高）
紫外线：对微生物有高度致死效应，主要是与菌体核酸的光化学反应 而造成菌体死亡。对营养细胞和芽孢均有效。但穿透力低，只适于表 面灭菌。X射线和γ射线:使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反 应，阻碍微生物代谢活动而导致菌体迅速死亡。虽然灭菌效果好，但 穿透力强，不安全不经济。
渣，去除罐壁上的污垢等。） 空罐灭菌时要排尽罐内空气，灭菌时保持蒸
汽通畅，保证灭菌彻底。 实罐灭菌时要防止原料结块。 进入发酵罐的物料要保证无菌。 严格按照操作规程执行。
阀门试漏的方法
法兰连接的死角
渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角
不锈钢衬里的死角
接种管路的死角
❖ 如下图a所示有一小段管路存在蒸汽不流通的 死角
1. 培 养 基 的 营 养 物 质 损 失 较 多 ， 灭菌后培养基的质量下降
2. 需 进 行 反 复 的 加 热 和 冷 却 ， 能 耗较高
3. 不适合于大规模生产过程的灭 菌
4.发酵罐的利用率较低
影响培养基灭菌的因素
❖ (1) 培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物 的耐热性, 高浓度有机物会包于细胞的周围形成一层薄膜, 影 响热的传递, 因此在固形物含量高的情况下, 灭菌温度可高些。 例如, 大肠杆菌在水中加热 60～65 ℃便死亡；在 10% 糖液 中, 需 70℃ 4～6min；在 30% 糖液中需 70℃ 30min。
比较各种微生 物对热的抵抗 能力大小
营养细胞、芽孢、病毒或孢子
培养基的灭菌方法
（一）分批灭菌（实罐灭菌） 培养基的分批灭菌就是将配制好
的培养基放在发酵罐或其它装置中， 通入蒸汽将培养基和所用设备一起 进行灭菌的操作过程，也称实罐灭 菌。
这种方法不需要其他的附属设备 ，操作简便，是国内外生产中常 用的方法。
注意： ❖空气除菌不彻底是发酵染菌的主要原因之一 。
比如一个通气量为 40m3/h 的发酵罐, 一天所 需要的空气量高达 960m3, 假如所用的空气中含 菌量 104个/m3, 那么一天将有 9.6×106个微生 物细胞进入发酵系统, 这么多杂菌的带入, 完全可 导致发酵失败。
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灭菌和消毒的概念
❖ (4) 泡沫 培养基的泡沫对灭菌极为不利, 因为泡沫中的 空气形成隔热层,使传热困难, 热难穿透过去杀灭微生物。 对易产生泡沫的培养基在灭菌时, 可加入少量消泡剂。对 有泡沫的培养基进行连续灭菌时更应注意。
无菌检查与染菌处理
无菌检查 （一）无菌试验 1.肉汤培养法 2.斜面培养法 3.双碟培养法 （二）染菌的判断 1.连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化
分批培养的优缺点
优点: 操作简单，周期短，染菌机会少， 生产过程和产品质量容易掌握。
缺点: 存在基质抑制的问题，产率低，不 适宜测定动力学数据。
连续培养（continuous culture）
连续培养是指微生物培养到对数生长期 时，在发酵罐中不断添加新鲜的培养基，同时 不断放出代谢物，使微生物细胞在近似恒定状 态下生长的培养方式。 特点：菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度 均处于恒定状态。
此外，还应指出的是，应当避免长时间的加热阶 段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而且 也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而 影响培养过程的顺利进行。
在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高 的情况，这时可以适当延长灭菌时间。
生产上甚至有用100℃蒸煮而达到彻底灭菌的实例。
如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用100蒸汽 蒸30min，杀死其中的营养细胞， 但孢子与细菌的芽孢没 有被杀死。 将蒸过的原料置于室温下过夜， 未被杀死的 孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细胞，再30min便可杀 死。如此连续反复进行2-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。
蒸汽
蒸汽
冷却水
无菌培养基
发酵罐
配料罐
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加热塔
维持罐
连续灭菌示意图
冷却管
间歇灭菌与连续灭菌的比较
灭菌方式
优点
缺点
加热器、维持罐（管） 和冷却器以及发酵罐
等都应先进灭菌
连续 灭菌
间歇 灭菌
1.灭菌温度高，可减少培养基中 营养物质的损失
2.操作条件恒定，灭菌质量稳定
3. 易于实现管道化和自控操作
4. 避免了反复的加热和冷却， 提高了热的利用率