洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶_一种应用前景广阔的生物催化剂

第7卷第5期2009年9月生 物 加 工 过 程

Ch i nese Journa l o f B ioprocess Eng i neer i ng V o.l 7N o .5Sep .2009

do:i 10.3969/.j issn .1762-3678.2009.05.001

收稿日期:2008-12-22

基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2006AA020203,2007AA05Z417,2007AA100703);教育部新世纪优秀人才基金资助

项目(NCET 07 0336);武汉市攻关项目(200720422138)

作者简介:汪小锋(1983 ),男,湖北安陆人,博士,研究方向:微生物学;闫云君(联系人),教授,博士生导师,E m ai:l yanyun j un@to m.co m

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶:

一种应用前景广阔的生物催化剂

汪小锋,贾 彬,刘 涛,杨江科,闫云君

(华中科技大学 生命与科学技术学院 分子生物物理教育部重点实验室,武汉430074)

摘 要:洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶对有机溶剂(醇)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等具有良好的抗性,在有机合成、对映体拆分、非水相催化等领域应用十分广泛。综述了洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的发酵生产、分离纯化、基因克隆与表达、固定化与生物印迹、蛋白质结构解析及应用研究等,并展望了其未来发展方向,以期为该工业酶的研发与广泛应用提供参考。

关键词:洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶;分离纯化;固定化;蛋白质结构

中图分类号:Q 814 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2009)05-0001-07

Burkholderia cepaci a li pase:a potenti al versatil e bi ocatal yst for

future bioche m ical i ndustry

WANG X iao feng ,JIA B in ,L IU Tao ,YANG Jiang ke ,YAN Y un jun

(K ey L aboratory ofM o lecu l ar B iophy si cs of t he M i n i stry of Educati on ,Co ll ege of L ife Sc i ence and T echno logy ,

H uazhong U niversity of Sc i ence &T echno l ogy ,W uhan 430074,Ch i na)

Abst ract :Burkholderi a cepaci a lipase (BCL )was found to have better resi s tance to hea,t organ i c so l vents ,ox idants ,surfactants ,detergents ,and pr o tease .It is w idely applied i n organic synthesis ,resolution

of race m ic m i x tures ,and non aqueous enzy m atic catalysi s .The fer m entative production ,i m m obilizati o n ,m o lecu lar i m printi n g ,gene clon i n g and overexpression ,purifica ti o n and applicati o n o f BCL w ere summ a rized .

K ey w ords :Burkholderi a cepacia li p ase (BCL);purification ;i m m ob ilization;pr o te i n struct u re 洋葱伯克霍尔德菌(Burkhol d eria cepacia ,BC )为G -

杆菌,由美国微生物学家W illia m Burkho lder 自腐坏洋葱中分离出来,是一组基因型不同、表型相近的细菌群,根据基因特征和表型特征至少可以

将B.cepacia 分为10个基因型[1]

,称为洋葱伯克霍尔德菌复合型(B.ce pacia co m p lex ,简称BCC )。洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶(B cepacia lipase ,BCL)对多

种有机溶剂(醇)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等有较好抗性,是目前在有机合成、洗涤剂

添加剂和非水相催化中应用最为广泛的脂肪酶之一[2]

。脂肪酶(EC 3 1 1 3)是一类特殊的酯键水解酶,能在油水界面上催化脂类物质分解、合成和酯交换等反应。作为重要的工业用酶,脂肪酶在食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域应

用十分广泛[3],在生物能源(生物柴油)、有机合成、药物手性拆分和工具酶等新型应用领域前景也十分广阔[4]。国外学者对BCL研究,主要集中在分子克隆、有机溶剂中的性质研究、酯合成、立体选择性、对应体拆分以及结构与功能的研究等,关于发酵工艺的报道较少。应用较多的是日本天野酶制品株式会社(Am ano Enzy m e I nc )商品化的PS脂肪酶。国内则只有本实验室对该脂肪酶进行了系统的研究与开发,目前,在基因克隆、高效表达、分离纯化、酶固定化、生物柴油制备应用等方面均取得了一系列成果。本文就BCL的发酵生产、分离纯化、基因克隆与表达、固定化、蛋白质结构及应用研究作全面综述。

1 发酵生产

国内外有关BCL发酵的报道较少,不同菌株的发酵条件存在较大差异。1988年,Lonon等[5]从胆囊纤维化肺炎病人体内分离出10株产脂肪酶的洋葱伯克霍尔德菌,发现活力最高菌株产生的BCL纯化后,其相对分子质量大约为2 5104,最佳p H为9 0,最佳反应底物为Tw een40。一般洋葱伯克霍尔德菌最适生长温度为30~35!,而Rath i等[6-7]报道了1株产BCL的耐热菌B ce pacia RGP 10最适生长温度范围为45~50!。采用响应面法优化发酵产酶条件,发现诱导时间、接种量和C源质量浓度是最重要的影响因素,减少C源的供应可以缩短脂肪酶生产的时间,蓖麻油为最佳诱导物,培养基中Ca2+和M g2+浓度分别为0 4mmo l/L和0 6 mmo l/L时脂肪酶产量最高。将摇瓶中优化的产脂肪酶培养基在14L发酵罐中培养15h后比酶活达到160U/mg。尹利等[8]也采用了响应面法对洋葱伯克霍尔德菌产脂肪酶发酵条件进行了优化,发现橄榄油、豆饼粉水解液以及初始p H是最显著的影响因素。汪小锋等[9]发现尿素、接种量以及初始pH 对B cepacia产脂肪酶影响显著,响应面法优化后的试验条件能够在10L发酵罐上成功实现放大。Fer nandes等[10]报道了以玉米糠为基质,质量分数5%的玉米油为诱导剂固态发酵生产BCL,72h后的平均比酶活为108U/g,冻干的脂肪酶能直接应用到酯化和转酯化反应中。

2 分离纯化

脂肪酶的酶制剂产品分为粗酶制剂和纯酶制剂,大多数工业应用不需要制备纯酶,然而纯化的程度会影响酶的利用率,医药和化妆品中使用的脂肪酶对其纯度要求较高,必须对粗酶制剂进行分离纯化才能满足应用要求。Sug i h ara等[11]采用Acri n o l杀菌处理发酵上清液后,通过M acro Prep m ethy lH I C疏水层析和Sephacry l S 100HR凝胶过滤两步纯化使BCL纯化了1120倍,收率为54%。纯化后的BCL相对分子质量3 65104Da,PI为5 1,最适底物为中短碳链的甘油三脂肪酸酯(C链长∀12),能裂解三油酸甘油酯所有的酯健,偏爱1,3位酯健;而Bor nscheuer等[12]将商品化的PS脂肪酶用苯基 琼脂糖CL 4B柱层析纯化后发现纯酶的相对分子质量3 41104,PI为4 3,偏爱中长碳链(C链长#8)和不饱和的甘油三脂肪酸酯。在体积分数70%的异丙醇体系中纯化BCL可以有效防止脂肪酶分子的团聚[13],通过错流过滤、两步异丙醇处理、液液萃取和疏水层析,脂肪酶被纯化400倍,收率为30%。工业上,多采用双水相系统进行脂肪酶的初步纯化。Terstappen等[14]利用基于表面活性剂(六乙二醇单十四醚)的双水相系统纯化了BCL,发现BCL显示偏好富集于表面活性剂相,单步纯化使脂肪酶浓缩了4倍,纯化了24倍。黄瑛等[15]采用PEG 2000(质量分数10%)/磷酸盐(质量分数15%)双水相系统纯化了洋葱伯克霍尔德菌G 63生产的脂肪酶,脂肪酶纯化了3 98倍,最高回收率达到87 25%。

3 脂肪酶基因克隆与表达

NCBI核酸数据库中可以检索到9条BCL基因序列,它们之间的同源性较高,序列相似性在87%~ 100%之间。洋葱伯克霍尔德菌复合型产生的脂肪酶几乎都具有耐有机溶剂和耐热性能以及在水相和非水相中具有较高的催化活力和独特的催化性质;但不同基因型的洋葱伯克霍尔德菌分泌的脂肪酶的酶学性质方面也存在一定的差异,主要表现在相对分子质量、等电点、底物特异性等方面[11-12]。常规使用的细菌学鉴定方法很难将BCC以及与之相似的细菌区分开,基于rec A基因限制性片段长度多态性分析和特异基因序列分析以及全基因组水平的分型等技术已经可以将洋葱伯克霍尔德菌复合菌群区分开,这将对BCC中基因型不同菌株产生脂肪酶的研究具有重要意义。

目前,有关BCL转录调控机制还没有完全被阐释清楚。BCL的转录受群体感应调控体系的影响。

B cepacia中至少存在2种不同的信号分子对脂肪

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