洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶_一种应用前景广阔的生物催化剂

第7卷第5期2009年9月生 物 加 工 过 程
Ch i nese Journa l o f B ioprocess Eng i neer i ng V o.l 7N o .5Sep .2009
do:i 10.3969/.j issn .1762-3678.2009.05.001
收稿日期:2008-12-22
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2006AA020203,2007AA05Z417,2007AA100703);教育部新世纪优秀人才基金资助
项目(NCET 07 0336);武汉市攻关项目(200720422138)
作者简介:汪小锋(1983 ),男,湖北安陆人,博士,研究方向:微生物学;闫云君(联系人),教授,博士生导师,E m ai:l yanyun j un@to m.co m
洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶:
一种应用前景广阔的生物催化剂
汪小锋,贾 彬,刘 涛,杨江科,闫云君
(华中科技大学 生命与科学技术学院 分子生物物理教育部重点实验室,武汉430074)
摘 要:洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶对有机溶剂(醇)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等具有良好的抗性,在有机合成、对映体拆分、非水相催化等领域应用十分广泛。

综述了洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的发酵生产、分离纯化、基因克隆与表达、固定化与生物印迹、蛋白质结构解析及应用研究等,并展望了其未来发展方向,以期为该工业酶的研发与广泛应用提供参考。

关键词:洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶;分离纯化;固定化;蛋白质结构
中图分类号:Q 814 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2009)05-0001-07
Burkholderia cepaci a li pase:a potenti al versatil e bi ocatal yst for
future bioche m ical i ndustry
WANG X iao feng ,JIA B in ,L IU Tao ,YANG Jiang ke ,YAN Y un jun
(K ey L aboratory ofM o lecu l ar B iophy si cs of t he M i n i stry of Educati on ,Co ll ege of L ife Sc i ence and T echno logy ,
H uazhong U niversity of Sc i ence &T echno l ogy ,W uhan 430074,Ch i na)
Abst ract :Burkholderi a cepaci a lipase (BCL )was found to have better resi s tance to hea,t organ i c so l vents ,ox idants ,surfactants ,detergents ,and pr o tease .It is w idely applied i n organic synthesis ,resolution
of race m ic m i x tures ,and non aqueous enzy m atic catalysi s .The fer m entative production ,i m m obilizati o n ,m o lecu lar i m printi n g ,gene clon i n g and overexpression ,purifica ti o n and applicati o n o f BCL w ere summ a rized .
K ey w ords :Burkholderi a cepacia li p ase (BCL);purification ;i m m ob ilization;pr o te i n struct u re 洋葱伯克霍尔德菌(Burkhol d eria cepacia ,BC )为G -
杆菌,由美国微生物学家W illia m Burkho lder 自腐坏洋葱中分离出来,是一组基因型不同、表型相近的细菌群,根据基因特征和表型特征至少可以
将B.cepacia 分为10个基因型[1]
,称为洋葱伯克霍尔德菌复合型(B.ce pacia co m p lex ,简称BCC )。

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶(B cepacia lipase ,BCL)对多
种有机溶剂(醇)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等有较好抗性,是目前在有机合成、洗涤剂
添加剂和非水相催化中应用最为广泛的脂肪酶之一[2]。

脂肪酶(EC 3 1 1 3)是一类特殊的酯键水解酶,能在油水界面上催化脂类物质分解、合成和酯交换等反应。

作为重要的工业用酶,脂肪酶在食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域应
用十分广泛[3],在生物能源(生物柴油)、有机合成、药物手性拆分和工具酶等新型应用领域前景也十分广阔[4]。

国外学者对BCL研究,主要集中在分子克隆、有机溶剂中的性质研究、酯合成、立体选择性、对应体拆分以及结构与功能的研究等,关于发酵工艺的报道较少。

应用较多的是日本天野酶制品株式会社(Am ano Enzy m e I nc )商品化的PS脂肪酶。

国内则只有本实验室对该脂肪酶进行了系统的研究与开发,目前,在基因克隆、高效表达、分离纯化、酶固定化、生物柴油制备应用等方面均取得了一系列成果。

本文就BCL的发酵生产、分离纯化、基因克隆与表达、固定化、蛋白质结构及应用研究作全面综述。

1 发酵生产
国内外有关BCL发酵的报道较少,不同菌株的发酵条件存在较大差异。

1988年,Lonon等[5]从胆囊纤维化肺炎病人体内分离出10株产脂肪酶的洋葱伯克霍尔德菌,发现活力最高菌株产生的BCL纯化后,其相对分子质量大约为2 5104,最佳p H为9 0,最佳反应底物为Tw een40。

一般洋葱伯克霍尔德菌最适生长温度为30~35!,而Rath i等[6-7]报道了1株产BCL的耐热菌B ce pacia RGP 10最适生长温度范围为45~50!。

采用响应面法优化发酵产酶条件,发现诱导时间、接种量和C源质量浓度是最重要的影响因素,减少C源的供应可以缩短脂肪酶生产的时间,蓖麻油为最佳诱导物,培养基中Ca2+和M g2+浓度分别为0 4mmo l/L和0 6 mmo l/L时脂肪酶产量最高。

将摇瓶中优化的产脂肪酶培养基在14L发酵罐中培养15h后比酶活达到160U/mg。

尹利等[8]也采用了响应面法对洋葱伯克霍尔德菌产脂肪酶发酵条件进行了优化,发现橄榄油、豆饼粉水解液以及初始p H是最显著的影响因素。

汪小锋等[9]发现尿素、接种量以及初始pH 对B cepacia产脂肪酶影响显著,响应面法优化后的试验条件能够在10L发酵罐上成功实现放大。

Fer nandes等[10]报道了以玉米糠为基质,质量分数5%的玉米油为诱导剂固态发酵生产BCL,72h后的平均比酶活为108U/g,冻干的脂肪酶能直接应用到酯化和转酯化反应中。

2 分离纯化
脂肪酶的酶制剂产品分为粗酶制剂和纯酶制剂,大多数工业应用不需要制备纯酶,然而纯化的程度会影响酶的利用率,医药和化妆品中使用的脂肪酶对其纯度要求较高,必须对粗酶制剂进行分离纯化才能满足应用要求。

Sug i h ara等[11]采用Acri n o l杀菌处理发酵上清液后,通过M acro Prep m ethy lH I C疏水层析和Sephacry l S 100HR凝胶过滤两步纯化使BCL纯化了1120倍,收率为54%。

纯化后的BCL相对分子质量3 65104Da,PI为5 1,最适底物为中短碳链的甘油三脂肪酸酯(C链长∀12),能裂解三油酸甘油酯所有的酯健,偏爱1,3位酯健;而Bor nscheuer等[12]将商品化的PS脂肪酶用苯基 琼脂糖CL 4B柱层析纯化后发现纯酶的相对分子质量3 41104,PI为4 3,偏爱中长碳链(C链长#8)和不饱和的甘油三脂肪酸酯。

在体积分数70%的异丙醇体系中纯化BCL可以有效防止脂肪酶分子的团聚[13],通过错流过滤、两步异丙醇处理、液液萃取和疏水层析,脂肪酶被纯化400倍,收率为30%。

工业上,多采用双水相系统进行脂肪酶的初步纯化。

Terstappen等[14]利用基于表面活性剂(六乙二醇单十四醚)的双水相系统纯化了BCL,发现BCL显示偏好富集于表面活性剂相,单步纯化使脂肪酶浓缩了4倍,纯化了24倍。

黄瑛等[15]采用PEG 2000(质量分数10%)/磷酸盐(质量分数15%)双水相系统纯化了洋葱伯克霍尔德菌G 63生产的脂肪酶,脂肪酶纯化了3 98倍,最高回收率达到87 25%。

3 脂肪酶基因克隆与表达
NCBI核酸数据库中可以检索到9条BCL基因序列,它们之间的同源性较高,序列相似性在87%~ 100%之间。

洋葱伯克霍尔德菌复合型产生的脂肪酶几乎都具有耐有机溶剂和耐热性能以及在水相和非水相中具有较高的催化活力和独特的催化性质;但不同基因型的洋葱伯克霍尔德菌分泌的脂肪酶的酶学性质方面也存在一定的差异,主要表现在相对分子质量、等电点、底物特异性等方面[11-12]。

常规使用的细菌学鉴定方法很难将BCC以及与之相似的细菌区分开,基于rec A基因限制性片段长度多态性分析和特异基因序列分析以及全基因组水平的分型等技术已经可以将洋葱伯克霍尔德菌复合菌群区分开,这将对BCC中基因型不同菌株产生脂肪酶的研究具有重要意义。

目前,有关BCL转录调控机制还没有完全被阐释清楚。

BCL的转录受群体感应调控体系的影响。

B cepacia中至少存在2种不同的信号分子对脂肪
2生 物 加 工 过 程 第7卷
酶的转录调控起重要的作用[16]。

脂肪酶基因的转录调节蛋白基因(LuxR)的失活也将极大降低了脂肪酶的产量[17]。

洋葱伯克霍尔德菌分泌脂肪酶的途径为GSP途径(General Secreti o n Pathw ay)。

GSP 途径分泌的脂肪酶具有N端信号肽,可被Sec 复合体识别,穿过内膜到达周质。

在周质中,BCL在特异的分子伴侣蛋白帮助下形成正确的折叠构像,并在Dsb蛋白酶的作用下形成一个分子内二硫键,从而形成有活性的脂肪酶。

随后脂肪酶通过由12个Xcp蛋白组成的孔状结构穿过外膜,分泌到胞外。

许多学者都发现BCL基因(L i p A)的表达需要一个伴侣基因(L i f)来帮助其折叠成有活性的构象[18]。

L i p A编码44个氨基酸的信号肽序列,L i p A 和L i f拥有一个共同的启动子,两者的比例为1∃1时是未成熟的脂肪酶加工和分泌所必须的。

由于大多数产脂肪酶的伯克霍尔德菌是潜在的致病菌,实现BCL基因的异源表达具有十分重要的意义,许多学者尝试将BCL基因在大肠杆菌中表达,但成功实现高效表达的很少。

Traub等[19]将BCL基因在大肠杆菌中表达,但发现表达蛋白以无活性的包涵体形式存在,需要一个复杂的复性过程。

这是由于大肠杆菌中没有Sec 复合体识别与转运系统,脂肪酶在大肠杆菌中大量表达时通常形成包涵体。

包涵体的形成对克隆子的筛选也会造成一定的困难。

Puech Gueno t等[20]最近开发了一种高通量的方法筛选不同的BCL重组子,极大地提高了筛选效率。

BCL基因异源表达时,必需同时表达L i p A和L if 才能获得有活性的脂肪酶。

L i f的大量表达对宿主细胞具有致死效应,因此,通过同源表达的方法提高脂肪酶基因的拷贝数和细胞膜分泌蛋白的拷贝数、增强分泌能力等途径提高脂肪酶的产量不失为一种简单有效的方法。

Y ang等[21]将克隆到的BCL 的L i p A和L i f连接在广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上,通过三亲杂交,在辅助质粒pR K2013的帮助下,转入原宿主菌B cepacia G63中,构建的同源高效表达基因工程菌的酶活力较原始菌株提高了3 6倍。

目前,为了开发更加高效的同源表达系统,本课题组正致力于构建基于T7表达系统的洋葱伯克霍尔德菌同源表达菌株。

4 固定化与生物印迹
固定化方法是生物催化剂实现其工业化应用的重要手段。

与游离酶相比,固定化酶具有稳定性好、易于分离、可以重复使用、反应条件易于控制等优点。

因此,BCL的固定化研究也成为该脂肪酶研究的一个热点。

与游离酶相比,固定化后的脂肪酶对底物特异性会发生改变。

Pencreac%h等[22]对比研究了B cepacia脂肪酶的游离酶和固定化酶的性质,发现固定化后的脂肪酶偏爱短链的脂肪酸酯,而游离酶偏爱长链脂肪酸酯。

BCL在有机溶剂中固定在多孔聚丙烯载体上后对广泛的底物有高活性,但对长链脂肪酸酯的活性较低[23]。

BCL经固定化后,其最适反应温度升高,催化酯化反应的活化能降低,且表现出良好的热稳定性以及对短链醇的耐受性。

不同的固定化材料以及载体的疏水性对固定化脂肪酶的性质影响较大。

BCL固定在陶瓷粒子(PS C)和硅藻土(PS D)上,在非水相催化醛肟和酮肟的酰基化反应时,2种脂肪酶的最适溶剂分别为四氢呋喃(TH F)和二氧杂环己烷(1,4 d i o x ane)[24]。

溶胶凝胶固定化方法是脂肪酶固定化中应用较为广泛的方法,以甲基三甲氧基硅烷(MTM S)和四甲氧基硅烷(TMOS)等硅烷耦连剂为前驱体制备的溶胶凝胶固定化BCL的活性和稳定性与游离酶都得到了显著提高[25-26]。

通过简单的吸附,BCL能与亲水性载体海藻酸钠进行生物耦合,这种可溶性的生物耦合物使酶的活性和稳定性都得到了提高,催化效率也大幅提高[27]。

刘涛[28]采用大孔树脂固定化洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶,使固定化脂肪酶的机械强度、酶活力以及稳定性均得到大幅提高。

固定化酶蛋白比活力游离酶提高了15 4倍,将大孔树脂固定化法与脂肪酶的生物印迹方法相结合,固定化脂肪酶比活力提高了19 4%。

最近生物印迹作为一种改良酶学特性、扩大脂肪酶工业应用领域的新兴技术正越来越受到人们的重视。

曹雄文等[29-30]系统研究了生物印迹与溶胶凝胶固定化相结合的方法对PS脂肪酶酯化活力的影响,并初步探讨了生物印迹的机制。

以MT M S和T MOS为前驱体,月桂酸为印迹分子,在最优反应条件下,印迹酶相对于游离酶比活力提高了44 3倍,相对于未印迹固定化酶提高了2 4倍。

印迹分子的疏水性与底物分子的相似性对印迹效果影响较大,疏水性越强,与底物分子相似性越大,印迹效果越好,印迹分子对脂肪酶酯化活力的提高主要通过影响聚合物的结构来改变固定化酶的酶活。

5 蛋白质结构
目前,许多脂肪酶的蛋白质结构已经被解析,
3
第5期汪小锋等:洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶:一种应用前景广阔的生物催化剂
NCB I结构数据库中收录BCL的3D结构信息有9条(检索方法:B urkholderi a cepacia AND li p ase)。

1997年,BCL的3D结构先后被多位学者解析[5,31],结构显示脂肪酶包含1个 / 水解折叠结构和催化三联体Ser87,H is286,A sp264,活性中心有1个钙离子结合位点,G ln88和Leu17的氨基N在 3链和 4链环状结构的C末端形成阴离子氧洞。

BCL结构暴露了1个溶剂易于接近的活性位点高开放构象。

这个结构表明细菌脂肪酶界面激活涉及二级结构的改变和大幅度的移动盖子结构使活性位点暴露出来。

Lang等[32]发现甘油三酯与BCL反应时有4个结合的&口袋∋结构,1个阴离子氧洞和3个与甘油三酯sn 1、sn 2和sn 3脂肪酸长链相匹配的&口袋∋。

为了合理设计和有效预测BCL与底物在有机合成反应中的反应性和对映选择性,许多学者致力于数学模型的开发研究。

Le mke等[33]开发了基于3 (aryloxy)propan 2 o ls反应动力学的脂肪酶活性位点的三维结构模型。

该模型能解释和预测是否接受化合物作为底物,并能够评价脂肪酶催化反应的对映体选择性。

BCL脂肪酶是生产高对映选择性的手性仲醇中应用最为广泛的催化剂之一,它的对映偏爱性主要取决于底物的结构,对映选择性取决于脂肪酶与底物原子的相互作用。

Schulz等[34]构建分子模型预测BCL对广泛的仲醇和芳香二级醇的对映选择性。

Hw ang等[35]通过计算机辅助建立分子模型研究BCL对各种饱和 内酯和! 内酯的对应选择性,发现BCL优先水解底物中的(R) 对映体。

Gentner等[36]建立了预测BCL与伯醇环状结构的对映体选择性的数学模型,发现只有偏爱性的对映体进入&H is沟∋(由H is286和Leu287形成),模型与实验数据吻合较好。

BCL是唯一1种对多种伯醇有高对映体选择性的微生物脂肪酶,通过改变活性中心附近Va l266和Leu17之间的距离可以显著改善BCL对伯醇的选择性。

最近,V illarea l等[37]基于BCL的结构开发了一个模型对BCL催化外消旋的1 苯基乙醇的对映选择性机理进行了深入研究,发现BCL在水相和有机相中表现出不同的对映选择性,对映选择性的改变是由于脂肪酶分子的构象发生改变所致。

6 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的应用
酶在非水相中仍具有催化活性这一发现大大扩展了酶在化工中的应用。

当转化的底物在水溶液中的溶解度较低或不稳定时,非水相催化反应是较好的选择。

BCL因对多种有机溶剂具有较高的抗性,因此成为非水相催化应用最为广泛的脂肪酶之一。

催化转酯化反应生产生物柴油、精细化工产品以及外消旋化合物的对映体拆分是目前BCL应用最多的领域。

6 1 酯合成与生物柴油的生产
游离的BCL在水相、微乳相和有机溶剂中均具有水解活力,固定化BCL在非水介质中有较高的酯合成和转酯活力,能催化多种酯的合成和转酯化生成多种化合物(如生物柴油)。

有机溶剂中BCL催化酯合成制备氢化肉桂醛酯的转化率能达到70%~80%,某些酯采用转酯化反应的转化率要比酯合成高[38]。

转酯化的效率与有机溶剂的疏水性密切相关,BCL偏爱高疏水性的溶剂(如正己烷)。

BCL脂肪酶在有机溶剂反应体系和无溶剂反应体系中,都表现出很高的催化活性和强甲醇抗性,并随体系中水分含量的减少而提高。

酶法生产生物柴油时,甲醇可以一次性加入到含有高甲醇抗性脂肪酶的反应体系中,使生产工艺得以简化。

所以,BCL是一种在酶法催化生产生物柴油中极具应用前途的脂肪酶。

N ouredd i n i等[26]以溶胶凝胶固定化BCL催化大豆油转酯化反应生产生物柴油,最佳反应条件下脂肪酸甲酯和乙酯的转化率分别达到67%和65%。

H su等[39]以页硅酸盐溶胶凝胶固定化的BCL(I M BS 30)为催化剂,在无溶剂体系的填充柱反应器中催化乙醇和餐饮废油转酯化反应生产生物柴油,反应48h,脂肪酸乙酯转化率大于96%。

Shah等[40]以硅藻土载体固定BCL为催化剂,在无溶剂体系中催化麻疯树油转化生产生物柴油,8h转化率就高达98%,固定化脂肪酶重复利用4次生物柴油转化率都保持不变。

刘涛[28]在无溶剂体系中采用大孔树脂固定化BCL催化大豆油制备生物柴油,反应8h其甲酯得率可高达98 98%,并且固定化酶表现出很好的操作稳定性,连续反应10个批次,其甲酯得率仍保持92%以上。

助溶剂(叔丁醇等)能够大大提高酯交换反应速率[41],从而提高生产设备的效率,降低能耗,受到人们的普遍重视。

随着有机溶剂中固定化BCL催化生产生物柴油研究的不断深入,生物柴油的生产效率和转化率还将得到进一步提高。

6 2 有机合成与对映体拆分
BCL在水相和非水相中都具有较高活性,对有
4生 物 加 工 过 程 第7卷
机溶剂具有耐受性,是绿色生物催化工业中应用前景十分广阔的脂肪酶之一。

BCL能够催化合成 氨基化合物、医药中间体以及许多手性化合物,对顺式异构体具有偏爱性。

微生物脂肪酶被广泛应用于光学异构体的拆分上,是目前国内外研究较多的拆分方法。

这使得以BCL为催化剂工业化生产化工产品具有巨大的市场潜力。

Kanerva等[42]研究了BCL在有机溶剂中催化合成了接近对映纯的 氨基酸酯,以2,2,2 三氟氯乙酸酯为助溶剂催化合成十脂环族的 氨基羧酸乙酯时BCL的立体选择性得到显著提高。

左羟丙哌嗪化学合成一般是外消旋的羟丙哌嗪,在有机溶剂中采用固定化的BCL 能够高效拆分羟丙哌嗪的外消旋化合物得到对映纯的R 羟丙哌嗪[43]。

薄荷醇是一种重要的医药中间体,以甲基丙烯酸肟作为酰基受体,固定化的BCL 在二异丙基醚中催化(() 薄荷醇合成手性的甲基丙烯酸薄荷酯单体(m ethacry late ester o f( ) m en thol)的收率可高达96%,ee值为98%[44]。

洋葱伯克霍尔德菌也可以作为一种全细胞催化剂应用于外消旋体的拆分。

Yu等[45]以BCL全细胞催化DL 薄荷醇乙酸酯制备L 薄荷醇,对映选择率E=170,转化率为50%,ee值为96%。

6 3 离子液体中的催化
离子液体作为溶剂已经在聚合反应、选择性烷基化和胺化反应、酰基化反应、酯化反应、支链脂肪酸的制备等方面得到应用,并显示出反应速率快、转化率高、反应的选择性高、催化体系可循环使用等优点。

最近,BCL在离子液体中的催化反应吸引了许多学者的广泛关注。

Nara等[46]报道了离子液体[bm i m]PF6中以PCL C催化二乙基辛基 1,8 乙二酸锡盐和1,4 丁二醇的缩聚反应,BCL在离子液体[C4M I m]PF6中催化氟脲苷苯甲酰化反应,其酶活力和区域选择性也显著提高[47]。

在离子液体[bm i m]PF6中,固定化的BCL(PS C)能以琥珀酸酐作为酰基受体催化外消旋二级醇制备对映纯的单体,添加三乙胺能显著提高反应速率[48]。

Shah等[49]报道BCL交联酶晶体能在离子液体[bm i m]PF6介质中高效拆分(R, S) 1 苯基乙醇,2h的转化率就高达50%,ee值达到99%,对映选择率E>1000,而游离脂肪酶转化率仅达8%。

6 4 洗涤剂工业中的应用
当前脂肪酶已成为洗涤剂行业中添加的第2大酶制剂,它不仅能高效地将油脂污垢分解成脂肪酸而被除去,还有利于环境保护。

废水处理时加入一定量的脂肪酶,可高效除去脂肪,减少废水处理的成本和降低二次污染。

BCL因具有强烈的抗氧化性以及良好的兼容性,在洗涤剂中添加BCL具有很大优势。

Rathi等[6]报道了一种来自洋葱伯克霍尔德RGP 10的新型碱性脂肪酶在洗涤剂工业中具有重要的应用价值。

该碱性脂肪酶能兼容各种离子型和非离子型表面活性剂以及商业洗涤剂。

在室温下,BCL有很强的抗氧化性,与H2O2,NaB O3和Na C l O等混合1h活性保持不变。

这种酶能耐受各种商业碱性蛋白酶,甚至在50!下经蛋白酶处理1h仍可保留完整活性;该脂肪酶还表现出较好的稳定性,比已商品化的Li pase更加适合于加入到商业洗涤剂中。

7 结语与展望
面对资源、能源和环境的挑战,开发资源节约型和环境友好型的化学工艺势在必行,非水相酶学的迅猛发展为化学工艺开辟了广阔的天地。

作为非水相酶学研究热点的脂肪酶更是受到研究者的重视。

脂肪酶的成本是制约其大规模工业化应用的瓶颈问题。

商品化的PS脂肪酶价格较高(粗酶约6000元/kg,蛋白质量分数为0 6%),如何降低BCL 的制备和使用成本已成为当前研究开发的重点。

降低BCL的制备和使用成本的途径很多,通过传统方法筛选与改良野生菌株、构建高效的同源与异源表达的基因工程菌株、开发先进的发酵控制工艺和分离纯化工艺以及固定化研究等都能有效降低脂肪酶的成本。

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶是一种酶学性质十分优良的细菌脂肪酶,也是目前应用最为广泛的脂肪酶之一,随着国内外对该脂肪酶研究的不断深入以及成本的降低,该脂肪酶的应用将拓展到更多工业应用领域。

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6生 物 加 工 过 程 第7卷。