基因工程第二章 基因工程工具酶
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基因工程-2-工具酶
1.制备DNA分子杂交探针(缺口平移Nick translation)
5‘ (a) 3’ 5‘ 3‘ 5’ 3‘
(a)DNaseI处理双链的DNA 分子
(b)带有3’-OH末端的单链缺口 (c) polⅠ从5‘-P移去一个核 苷酸 (d) polⅠ将32P标记的核苷 酸参入取代被移去的核苷酸 (e)重复(c)(d)的步骤，缺口 沿5’-3‘方向移动，形成32P标记 的核苷酸合成的DNA链
HindⅢ Bacillus amyloliquefaciens H
BamHⅠ
Escherichia coli R质粒
EcoRⅠ
六、限制内切酶的反应体系
DNA 1μ l(1μ g)
buffer(10×)
ddH2O 限制性内切酶 总体积
2μ l
16μ l 1μ l(1u) 20μ l
A）确定酶切DNA的量
100～200 units
up to 20 μl
70℃保温15分钟后冰上冷却，得到第一链cDNA。
4个 6个
44 =256
λDNA 49Kb
46=4096
48 =65536
12位点。 Bgl II 6个；BamH I 5个；Sal I 2个。
三、II型限制性内切酶切割类型
1、平齐末端（Blunt end）
Hind II 切割反应
Sma I 切割反应
2、粘性末端（Sticky end） 2.1 产生5’粘性末端
(b) (c)
3’
5‘ 3’ 5‘
5’
3‘ 5’ 3‘ 5’
(d)
3’
* *** ****
5‘ (e) 3’
3‘ 5’
五、DNA聚合酶的应用
2.制备DNA分子杂交探针(随机引物法)
5‘ (a) 3’ 5‘ 3‘ 5’ 3‘
(a)DNaseI处理双链的DNA 分子
(b)带有3’-OH末端的单链缺口 (c) polⅠ从5‘-P移去一个核 苷酸 (d) polⅠ将32P标记的核苷 酸参入取代被移去的核苷酸 (e)重复(c)(d)的步骤，缺口 沿5’-3‘方向移动，形成32P标记 的核苷酸合成的DNA链
HindⅢ Bacillus amyloliquefaciens H
BamHⅠ
Escherichia coli R质粒
EcoRⅠ
六、限制内切酶的反应体系
DNA 1μ l(1μ g)
buffer(10×)
ddH2O 限制性内切酶 总体积
2μ l
16μ l 1μ l(1u) 20μ l
A）确定酶切DNA的量
100～200 units
up to 20 μl
70℃保温15分钟后冰上冷却，得到第一链cDNA。
4个 6个
44 =256
λDNA 49Kb
46=4096
48 =65536
12位点。 Bgl II 6个；BamH I 5个；Sal I 2个。
三、II型限制性内切酶切割类型
1、平齐末端（Blunt end）
Hind II 切割反应
Sma I 切割反应
2、粘性末端（Sticky end） 2.1 产生5’粘性末端
(b) (c)
3’
5‘ 3’ 5‘
5’
3‘ 5’ 3‘ 5’
(d)
3’
* *** ****
5‘ (e) 3’
3‘ 5’
五、DNA聚合酶的应用
2.制备DNA分子杂交探针(随机引物法)
基因工程操作的工具酶
也称为Kronberg酶，是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。
具有三种酶活性
a、5’ ---3’DNA聚合酶活性
CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT
GGCTATCGGA Mg2+ dNTP
GGCTATCGGA
.
46
b、3’ ---5’ 外切酶活性
.
44
3. DNA聚合酶
分为两类： ①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌
DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。
.
45
DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：
.
21
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
.
22
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
.
14
限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸，这些序列大多呈回纹结构。
Eco RⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
.
15
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
《基因工程》第二章工具酶
•E.coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能 被完全修饰（因此完全不能被 MboI 切割），而 λDNA 只有大约 50% 的 Dam 位点被甲基化，这是因为在 λDNA 被包装到噬菌体头 部之前，甲基化酶还没来得及将 DNA 完全甲基化。因此，被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻断的酶却能对这些 λDNA 进行部分切割。
•5’……G*A-A-T-T- C……3’ •3’……C- T- T-A-A*G……5’
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《基因工程》第二章工具酶
讨论:下面的序列中可能含有多 少个潜在的酶切位点?
•1
•2
•3
•4
•5
•GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAG
A
•6
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《基因工程》第二章工具酶
•一、DNA限制性内切酶 •二、甲基化酶 • 三、分子克隆过程中所需要的另一些酶
Hale Waihona Puke PPT文档演模板《基因工程》第二章工具酶
•（一）DNA聚合酶 •（二）RNA聚合酶 •（三）反转录酶 •（四）核酸外切酶 •（五）核酸酶S1
•（六）DNA酶 •（七）RNA酶 •（八）连接酶 •（九）末端转移酶 •（十）碱性磷酸酶
•1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种 作用：
•①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填 补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 •②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。
•③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。
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•DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中， 能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者 是胞嘧啶上。
•5’……G*A-A-T-T- C……3’ •3’……C- T- T-A-A*G……5’
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《基因工程》第二章工具酶
讨论:下面的序列中可能含有多 少个潜在的酶切位点?
•1
•2
•3
•4
•5
•GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAG
A
•6
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《基因工程》第二章工具酶
•一、DNA限制性内切酶 •二、甲基化酶 • 三、分子克隆过程中所需要的另一些酶
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•（一）DNA聚合酶 •（二）RNA聚合酶 •（三）反转录酶 •（四）核酸外切酶 •（五）核酸酶S1
•（六）DNA酶 •（七）RNA酶 •（八）连接酶 •（九）末端转移酶 •（十）碱性磷酸酶
•1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种 作用：
•①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填 补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 •②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。
•③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。
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•DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中， 能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者 是胞嘧啶上。
第二章 基因工程工具酶.限制酶
c. 产生的末端特征： 产生的末端特征： 我们所说的粘性末端是指DNA分子在 限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的 单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱 基间的配对而重新环化起来。 平末端的DNA片段则不易于重新环化。
(2) 同裂酶 (isoschizomers) 有一些来源不同的限制酶识别的 是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称 为同裂酶(isoschizomers)。 同裂酶产生同样的切割，形成同 样 的 末 端 。 例 如 ， 限 制 酶 HpaⅡ 和 MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列 是CCGG。
（2） 用一个写在右下方的标注字母代表 菌株或型，例如Ecok。 （3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个 不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表 示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制 与 修 饰 体 系 分 别 表 示 为 HindI 、 HindII 、 HindIII等等。
（4）所有的限制酶，除了总的名称核酸内切限制 酶R外 ， 还带 有 系统 的 名称 ， 例如核 酸内切 酶 R．HindIII。同样地，修饰酶则在它的系统名称 之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶 R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名 为甲基化酶M. HindIII。 在实际应用上， 在实际应用上 ， 这个命名体系已经作了进一 步的简化： 步的简化： ①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以 现在通行的是把全部略语字母写成一行。 ②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶 的地方，核酸内切酶的名称R便被省去。
位于寄主特 异性位点或 其附近
距寄主特异 性位点3，端 24~26bp处
寄主特异性 的位点
寄主特异性 的位点
识别未甲基 化的序列进 行核酸内切 酶切割 序列特异的 切割 DNA 克 隆 中 的用处
第二章 基因工程工具酶[可修改版ppt]
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5′ … G C T G A A T T C G A G … 3′ 3′ … C G A C T T A A G C T C … 5′
5’ G↓G-A-T-C-C 3’ 3’ C-C-T-A-G↑G 5’
切点大多数在识别序列之内，也有的在序列两侧
Sau3AⅠ EcoRⅡ NciⅠ EcoRⅠ
5′ … ↓GATC … 3′ 5′ … ↓CCWGG… 3′ 5′ … CC↓SGG … 3′ 5′ … G↓AATTC … 3′
②粘性末端标记
凸出的5 ’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的 3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如 AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
（6） 同位酶、同尾酶与同裂酶
同位酶：具有相同的识别序列，但是酶切位点不同。
生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是restriction,修饰 modification,所以把这一系统叫做：R/M体系。 限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一种是核 酸内切酶。
限制与修饰存在两 方面的作用：一是 保护自身的DNA不 受限制，即不被切 割；二是破坏外源 DNA使之迅速降解。
种名 株系 编号 母。
（5）限制性核酸内切酶的特征
特异的识别序列、严格切割位点
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5′ … G C T G A A T T C G A G … 3′
3′ … C G A C T T A A G C T C … 5′
识别序列 与DNA的 来源无关
Cleavage sites
1 1
限制（Restriction）
基因工程(第二章答案)
第二章基因工程工具酶一、解释下列名词1.Restriction and modification（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends(or cohesive end)（匹配末端或粘性末端）识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Star activity星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
5. Klenow fragment Klenow 片段。
Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。
6.Reverse transcriptase反转录酶。
即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA活性，但是无3'--5' 外切活性。
7.Terminal transferase（末端转移酶）8.Ligase连接酶。
催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。
9.T4 polynucleotide kinase（T4多聚核苷酸激酶）催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。
10.Alkaline phosphatase（碱性磷酸酶）催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸11.S1 nuclease Sl 核酸酶。
可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。
基因工程2-工具酶中国药科大学生物工程所有
星号（*）活性
星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。
（7）限制酶的酶活性
EcoR I和BamH I等都有*活性,使用时要注意！！
在低盐、高pH（>8）时可识别和切割
GAATTA、AAATTC、GAGTTC等
GAATTC
EcoR I：
如： ECORI★识别特异性放宽，GAATTC→AATT
较高的甘油浓度（>5% v/v）； 酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>100 U/µg）； 低盐浓度（<25 mM） 高pH值（>pH 8.0） 存在有机溶剂（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等） 用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）
04
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA；四、五或六个碱基对，而且具有180°旋转对称的回文结构。 与DNA的来源无关。
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’
3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
EcoR I的识别序列
EcoR I的切割位点
补平成平齐末端
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
②5’末端标记
识别位点的序列相同的限制性内切酶。 （5）同裂酶（Isoschizomers) ① 完全同裂酶(同位酶)： 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。 Hind Ⅲ 5’-AÜAGCTT-3’ 3’-TTCGAÛA-5’ Hsu I 5’-AÜAGCTT-3’ 3’-TTCGAÛA-5’
基因工程02基因工程工具酶
识别位点：未甲基化修饰的15bp左右特异序列，非对称性 。
酶切位点：在距离特异性识别位点约1000—1500 bp
处随机切开一条单链
作用机理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
I 型限制性内切酶具有极强的ATPase的活性，每打开一个 磷酸二脂键就需要消耗1000个分子的ATP。
限制一修饰体系，其功能就是 保 护 自 身 的 DNA ， 分 解 外 来 的 DNA ， 以 保 护 和 维 持 自 身 遗传信息的稳定，这对细菌的 生存和繁衍具有重要意义。
1.2 限制性内切酶的类型 Types of restriction and modification (R-M) system
切割位点两侧序列的核苷酸组成与切割效率有关， 即某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱 性切割。
*Site preference（偏爱位点）
原因
1.边界碱基的辅助识别：与识别序列邻近的特异性边界碱 基可以提高酶切速度，对酶的识别起到辅助作用。 2.甲基化：限制酶识别序列内或其附近的胞嘧啶、腺嘌呤 或尿嘧啶被甲基化后，会阻碍限制酶的活性。（限制与修 饰现象。受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。） 3. 底物的构象：DNA分子的不同构型对限制酶的活性也 有很大影响。有些酶切割超螺旋DNA和线状DNA时会表 现出差异。
3. 非互补的粘性末端：酶切位点在识别序列之外的。
① 5’粘性末端(protruding 5' ends)
② 3’粘性末端(protruding 3' ends)
③ 平末端（Blunt End）
④ 非互补的粘性末端
粘性末端的意义或者在基因工程中的作用
① 连接便利 a)不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补 就可以连接。这比连接两个平末端要容易的多。 b) 同一个DNA分子内连接：通过两个相同的 粘性末端可以连接成环形分子。
酶切位点：在距离特异性识别位点约1000—1500 bp
处随机切开一条单链
作用机理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
I 型限制性内切酶具有极强的ATPase的活性，每打开一个 磷酸二脂键就需要消耗1000个分子的ATP。
限制一修饰体系，其功能就是 保 护 自 身 的 DNA ， 分 解 外 来 的 DNA ， 以 保 护 和 维 持 自 身 遗传信息的稳定，这对细菌的 生存和繁衍具有重要意义。
1.2 限制性内切酶的类型 Types of restriction and modification (R-M) system
切割位点两侧序列的核苷酸组成与切割效率有关， 即某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱 性切割。
*Site preference（偏爱位点）
原因
1.边界碱基的辅助识别：与识别序列邻近的特异性边界碱 基可以提高酶切速度，对酶的识别起到辅助作用。 2.甲基化：限制酶识别序列内或其附近的胞嘧啶、腺嘌呤 或尿嘧啶被甲基化后，会阻碍限制酶的活性。（限制与修 饰现象。受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。） 3. 底物的构象：DNA分子的不同构型对限制酶的活性也 有很大影响。有些酶切割超螺旋DNA和线状DNA时会表 现出差异。
3. 非互补的粘性末端：酶切位点在识别序列之外的。
① 5’粘性末端(protruding 5' ends)
② 3’粘性末端(protruding 3' ends)
③ 平末端（Blunt End）
④ 非互补的粘性末端
粘性末端的意义或者在基因工程中的作用
① 连接便利 a)不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补 就可以连接。这比连接两个平末端要容易的多。 b) 同一个DNA分子内连接：通过两个相同的 粘性末端可以连接成环形分子。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
2 基因工程的工具酶
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 3 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇
在限制修饰系统中，限制作用是指一定类 型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用， 破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得 外源DNA对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基 化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化 ，可免遭自身限制性内切酶的破坏。 限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性 内切酶降解外源DNA ，维护自身遗传稳定的保 护机制。
5’
PvuⅡ 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH
3’ … C-G-A-G-T-C-P 3‘
P-C-T-G-G-A-G OH-G-A-C-C-T-C
…
… 5’
星号活性（star activity） 又称星活性，一些限制性内切酶在某 些反应条件变化时酶的专一性发生改变 ，如酶浓度过高、反应液离子强度过低 、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶 切割位点专一性发生改变。
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ BclⅠ
BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种酶可产生 相同的5’GATC粘性末端，由这种 同尾酶产生的DNA片段可因粘性末 端的互补而彼此再连接起来。
5’-AGATCT-3’
3’-TCTAGA-5’ BglⅡ
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
P OH
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SfiI GGCC N N N N N GGCC
CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 起
２）富含ＧＣ
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液 ，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后 ，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
七. 其它特异性的内切酶及其用途
1. λ末端酶（λ terminase）：
5’-GGGCGGCGACCTN--3’ N--5’，出现的频率约412
分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000）
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATTC-3’ HOG-5’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性：
加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的 腺嘌呤引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等， 但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。
2. Omega核酸酶（I-SceI）：
由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp，其识别顺序为
5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’
TATT
3. I-PpoI：来自于Physarum polycephalum
识别序列： CTCTCTTAA GGTAGC
表2 对甲基化敏感的限制性内切酶
限制酶
AvaⅡ BclⅠ ClaⅠ EcoRⅡ HphⅠ MboⅠ NruⅠ Sau96Ⅰ SauFⅠ StuⅠ TagⅠ XbaⅠ
识别序列* GG(A/T)CC(A/T)GG
TGATCA GATCGAT CC(A/T)GG GGTGATC GATC GATCGCGA GGNCC(A/T)GG CC(A/T)GG AGGCCTGG GATCGA TCTAGATC
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；
大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或 5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶引入甲基，受其影响的 酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。
采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA， 可防止DNA的甲基化。
③ 酶切反应的温度
多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或 30℃ ，SfiI为50℃ 。
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是
５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制 酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。
AATT
4. 用途
遗传标记， 构建载体
八. 限制酶的用途
1. DNA重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制 3. 突变分析（RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切与完全酶切
附：IIS型限制酶的特点
1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不 具有对称结构。
2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位 点的一侧，1-- 20nt。 3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。 4. 产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。 5. 均为单体，分子量为47—108 kD。
②酶用量过大，大于100U/微克DNA。
③低离子强度，小于25mmol/L。
④高pH，大于8.0。
⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。
⑥ Mn2+ 、 Cu2+ 、 Co2+ 、 Zn2+ 等 非 Mg2+ 的 二 价 离子的存在。
常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、 KpnI、PstI、SalI、HinfI等。
Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次 操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积 应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓 度超过5%时将会抑制酶的活性。
②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而 且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。
③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间， 减少酶的用量。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
M．HpaI C mCGG
HpaI C CGG 相同
2. E．coli 的dam、dcm甲基化酶
这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制 修饰系统。
dam G mATC， dcm C mCA/TGG
3. 哺乳动物的甲基化酶
PstI
1, 2, 4, 7
PvuⅡ
2, 4
SalI
1, 2, 4, 7
ScaI
4 - 6, 8
SstⅡ
2, 4
XbaI
2, 4, 7
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；
5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
BamHI + BglII A/G GATCT/C
不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分 子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种 末端可以相互连接。
五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制 酶
2. 特点：1）识别相同顺序
识别顺序是完全重叠还是边界重叠
如：完全重叠 BclI—dam(GATC)；ScrFI—
dcm(CCA/TGG)
边界重叠 ClaI--dam；
Sau96I--dcm
2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序
为何种重叠
如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm—
BstNI
第二章 分子克隆 工具酶及其应用
分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG
SacI CCGC GG
六.限制酶的星反应（star activity）
1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低
2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页）
3. 星反应的利用和避免
1.Ⅱ 限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 星 活 性 (star activity)
甲基化酶 dcm dam dam dcm dam dam dam dcm dcm dcm dam dam
*下横线字母表示限制酶识别序列, 绿色字母表示dam甲基 化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列
表1 具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶
诱发星活性的条件a
识别序列
AvaI
1, 2, 4
BamHI
1 - 5Байду номын сангаас 8
G GATCN, G PuATCC
BstI
2, 4
BsuI
2, 4, 6
EcoRI
1, 2, 4 - 6
N AATTN
HaeⅢ
2, 4
HhaI
2, 4, 7
HindⅢ
6
HpaI
1, 2, 4
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’
3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 起
２）富含ＧＣ
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液 ，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后 ，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
七. 其它特异性的内切酶及其用途
1. λ末端酶（λ terminase）：
5’-GGGCGGCGACCTN--3’ N--5’，出现的频率约412
分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000）
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATTC-3’ HOG-5’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性：
加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的 腺嘌呤引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等， 但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。
2. Omega核酸酶（I-SceI）：
由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp，其识别顺序为
5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’
TATT
3. I-PpoI：来自于Physarum polycephalum
识别序列： CTCTCTTAA GGTAGC
表2 对甲基化敏感的限制性内切酶
限制酶
AvaⅡ BclⅠ ClaⅠ EcoRⅡ HphⅠ MboⅠ NruⅠ Sau96Ⅰ SauFⅠ StuⅠ TagⅠ XbaⅠ
识别序列* GG(A/T)CC(A/T)GG
TGATCA GATCGAT CC(A/T)GG GGTGATC GATC GATCGCGA GGNCC(A/T)GG CC(A/T)GG AGGCCTGG GATCGA TCTAGATC
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；
大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或 5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶引入甲基，受其影响的 酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。
采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA， 可防止DNA的甲基化。
③ 酶切反应的温度
多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或 30℃ ，SfiI为50℃ 。
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是
５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制 酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。
AATT
4. 用途
遗传标记， 构建载体
八. 限制酶的用途
1. DNA重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制 3. 突变分析（RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切与完全酶切
附：IIS型限制酶的特点
1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不 具有对称结构。
2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位 点的一侧，1-- 20nt。 3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。 4. 产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。 5. 均为单体，分子量为47—108 kD。
②酶用量过大，大于100U/微克DNA。
③低离子强度，小于25mmol/L。
④高pH，大于8.0。
⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。
⑥ Mn2+ 、 Cu2+ 、 Co2+ 、 Zn2+ 等 非 Mg2+ 的 二 价 离子的存在。
常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、 KpnI、PstI、SalI、HinfI等。
Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次 操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积 应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓 度超过5%时将会抑制酶的活性。
②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而 且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。
③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间， 减少酶的用量。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
M．HpaI C mCGG
HpaI C CGG 相同
2. E．coli 的dam、dcm甲基化酶
这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制 修饰系统。
dam G mATC， dcm C mCA/TGG
3. 哺乳动物的甲基化酶
PstI
1, 2, 4, 7
PvuⅡ
2, 4
SalI
1, 2, 4, 7
ScaI
4 - 6, 8
SstⅡ
2, 4
XbaI
2, 4, 7
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；
5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
BamHI + BglII A/G GATCT/C
不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分 子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种 末端可以相互连接。
五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制 酶
2. 特点：1）识别相同顺序
识别顺序是完全重叠还是边界重叠
如：完全重叠 BclI—dam(GATC)；ScrFI—
dcm(CCA/TGG)
边界重叠 ClaI--dam；
Sau96I--dcm
2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序
为何种重叠
如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm—
BstNI
第二章 分子克隆 工具酶及其应用
分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG
SacI CCGC GG
六.限制酶的星反应（star activity）
1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低
2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页）
3. 星反应的利用和避免
1.Ⅱ 限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 星 活 性 (star activity)
甲基化酶 dcm dam dam dcm dam dam dam dcm dcm dcm dam dam
*下横线字母表示限制酶识别序列, 绿色字母表示dam甲基 化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列
表1 具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶
诱发星活性的条件a
识别序列
AvaI
1, 2, 4
BamHI
1 - 5Байду номын сангаас 8
G GATCN, G PuATCC
BstI
2, 4
BsuI
2, 4, 6
EcoRI
1, 2, 4 - 6
N AATTN
HaeⅢ
2, 4
HhaI
2, 4, 7
HindⅢ
6
HpaI
1, 2, 4
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’
3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG