4.2酶偶联法测定酶活性
生化检验复习题
习题集（教材：《生物化学检验》，李萍主编，人民卫生出版社，2002年第2版）一、名词解释1、抗凝剂2、决定性方法3、参考方法4、常规方法5、标准品6、一级标准品7、二级标准品8、控制物9、实验误差 10系统误差 11、随机误差 12、精密度 13、准确度 14、特异度 15、干扰 16、检测能力 17、回收试验 18、回收率 19、允许分析误差 20、参考值 21、参考范围 22、医学决定水平 23、金标准 24、ROC曲线 25、质量控制26、质控品 27、实验室认可 28、光谱分析 29、酶活性 30、酶活性单位 31、酶活性国际单位 32、延滞期 33、线性期 34、偏离线性期35、固定时间法 36、连续监测法 37、工具酶 38、心肌酶 39、急性时相反应蛋白 40、Lowry改良法 41、糖尿病 42、酮血症 43、OGTT 44、脂蛋白受体 45、清道夫受体46、残粒受体 47、高脂蛋白血症 48、脱水 49、高渗性脱水 50、等渗性脱水 51、低渗性脱水 52、水肿 53、血氧饱和度 54、Bohr效应 55、二氧化碳分压 56、氧分压 57、二氧化碳总量 58、实际碳酸氢盐 59、标准碳酸氢盐 60、缓冲碱 61、碱剩余 62、阴离子隙 63、微量元素 64、δ-胆红素 65、生物转化 66、卡门氏单位 67、肾小管重吸收 68、假肌酐 69、AMI 70、心脏标志物二、填空1、英译汉：NCCLS的中文全称是；IFCC的中文全称是。
2、IQC、 TRF、 APR、 GFR的中文全称依次为、、、。
3、BE的中文全称为，AG为，AB为，BB为。
4、生化检验常用的体液标本有、、和等，其中以标本最为常用。
5、生化检验中，是最常用的血液标本，是最常用的采血方法6、生化检验中常用的抗凝剂有、等。
7、血气分析多使用血。
8、离子交换法得到的纯水的纯度（高于/低于）蒸馏法得到的纯水的纯度。
9、临床实验室用水，一般选用级水，级水用于特殊实验，级水用作仪器的自来水清洁后冲洗。
4.1酶活性测定有哪些方法
③由于酶偶联技术的应用连续监测法的应用范围得以 大大地扩展(无需S、P间有特性差异)
④除上述两法外还有其他一些方法：平衡法
平衡法（又称终点法）
通过测定酶反应开始至反应达到平衡时 产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方 法。
谢 谢！
优点：动态了解反应v,易区分零级和一级反应期及延滞期 缺点：a.测定时需保温
b.检测有限制：△被测物S与P间理化特性要有差异 △显色剂对酶活性无影响
保温装置
注意：
①连续监测法测定包括了: 延滞期、线性期、非线性期(动态期)v 平衡期v
动态定量描述：早期称动态法
②速度计算;
a.线性期，初v符合米氏方程的变量关系
定时法可能引起的误差
A.两点间呈线性（少见） B.线性期短，大部分
为非线性(最常见) C.包括了延滞期 D.包括延滞期和非线性部分
∵测定不够准确，
实际测得平均v 结果偏低
定时法可能引起的误差示义图
[P]
A
D
C
B
t0
t
t
连续监测法：
定义：连续 (间隔15”~1’)测定酶反应过程中某一反应产物 或底物浓度随时间的变化来求酶反应初速度的方 法 — 动力学方法, 速率法
非线性期v不能简单地按米氏方程的计算它是表观速度vapp或称反应净速度存在逆反应实际酶测定时的时间进程曲线图表观速度vappor称反应净速度vms常数kss常数由于酶偶联技术的应用连续监测法的应用范围得以大大地扩展无需sp间有特性差异除上述两法外还有其他一些方法
酶活性测定有哪些方法
Progress curve of a typical enzyme reaction
pepc酶活的测定
2. 实验试剂：50mM ATP溶液，50mM磷酸肌酸溶液，0.2mM NaHCO3溶液，160U/ml 磷酸肌酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶溶液（U为酶活力单位），25mM RuBP溶液，5mM NADH，Rubisco提取介质（40mM Tris-HCl缓冲液，pH7.6，内含10mM MgCl2溶液，0.25mM EDTA，5mM谷胱甘肽），反应介质（0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.8，内含12mM MgCl2溶液，0.4mM EDTA）。
3实验步骤3.1 酶粗提液的准备取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10,000×g离心10min，弃沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C备用（王维光，1985；张志良等，2003）。
3.3.2 Rubisco酶活力的测定按下表配制反应体系：试剂加入量ml5mM NADH 0.250mM ATP 0.2酶提取液0.150mM磷酸肌酸0.20.2mM NaHCO30.2反应介质1.4160U/ml磷酸肌酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶0.1双蒸水0.3将配制好的反应体系混匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计计上测量340nm处反应体系的OD值，作为零点值。
将0.1mlRuBp加入比色杯内，立即计时，每隔20s测一次OD值，共测3min。
以零点到第1min 的OD值下降的绝对值计算酶活力。
由于酶提取液中可能存在3-磷酸甘油酸（PGA），会使酶活力的测定产生误差，因此除上述测定外还需做一个不加RuBp的对照。
对照的反应体系与上述酶的反应体系完全一样，所不同的仅仅是把酶提取液放在最后加，加入后马上测定此反应体系340nm处的OD值，并记录前1min内OD值的变化量。
2023年检验类之临床医学检验技术(中级)通关提分题库及完整答案
2023年检验类之临床医学检验技术（中级)通关提分题库及完整答案单选题（共40题）1、下列成分不直接参与Ⅱ型超敏反应的是A.CDB.巨噬细胞C.补体D.NK细胞E.IgG、IgM【答案】 A2、下列有关ISI的叙述，错误的是（）A.即组织凝血活酶的国际敏感指数B.67/40批号的ISI定为1.0C.ISI值越高说明该试剂越敏感D.ISI与INR的计算直接有关E.ISI通常由厂家提供【答案】 C3、以下有关酶偶联法测定酶活性浓度的描述，错误的是A.往往利用一个以上的工具酶B.测定延滞期越短越好C.指示酶的反应必须是一级反应D.一般指示酶的Km值都很大E.指示酶的用量要适量【答案】 D4、关于等渗脱水，错误的是（）。
A.常见于消化液丧失的情况B.不会发生代谢性酸中毒或碱中毒C.细胞外液减少D.细胞内液正常E.导致血容量不足【答案】 B5、电阻抗法血液分析仪的发明者是A.MoldavanB.PoolegererantzD.CouherE.Humter【答案】 D6、免疫球蛋白的型及亚型分类依据是A.VH抗原性的不同B.CH抗原性的不同C.VL抗原性的不同D.CL抗原性的不同E.以上都不是【答案】 D7、对蛋白质有较好清洗能力的洗液为A.尿素洗液B.蒸馏水C.稀碳酸氢钠水溶液D.乙二胺四乙酸二钠洗液E.合成洗涤液【答案】 A8、[患者女，34岁，寒战，发热伴腰痛，尿频1天，体格检查，体温38.3摄氏度，左肾区叩击痛，血白细胞明显升高，尿液分析：尿白蛋白（1＋），白细胞30～50/HP，亚硝酸盐（1＋）]。
A.大肠埃希菌B.产碱杆菌属C.铜绿假单胞菌D.真菌E.金黄色葡萄球菌【答案】 A9、检查菌体不同结构成分及抗原与特异性抗体结合形成复合物时须用A.普通显微镜B.荧光显微镜C.暗视野显微镜D.倒置显微镜E.照相显微镜【答案】 B10、青少年血清中明显高于正常成年人的酶是（）。
A.ALTB.ASTC.ALPD.AMYE.LDH【答案】 C11、GHb一般可反映糖尿病病人多长时间内血糖的平均水平A.1～2周B.3～4周C.5～6周D.6～8周E.12～15周【答案】 D12、揭示了医学研究团结同道的协作性原则( )A.由个人完成发明创造的时代，已经同爱迪生一去不复返了B.仅从个人兴趣或追逐个人利益出发选择研究课题是不道德的C.1969年至1981年的12年间，年轻的心脏病研究者约翰·达西博士共编造假论文100篇以上D.居里夫人把氯化镭包在自己的前臂上观察镭对人的皮肤的烧伤状况，表现了崇高的道德E.尸体解剖有利于医学的发展和总结医疗经验【答案】 A13、显微镜计数白细胞时，以测定值和靶值差值的绝对值与靶值相比来表示的质量控制的方法为（）。
高级卫生专业资格正高副高临床医学检验临床基础检验技术专业资格(3)_真题-无答案51
高级卫生专业资格（正高副高）临床医学检验临床基础检验技术专业资格(正高副高)模拟题2021年(3)(总分95.XX02,考试时间120分钟)多项选择题1. 手工法计数网织红细胞时应注意A. 最好采用玻片法染色B. 必须使用新亚甲蓝染色C. 涂片宜薄而均匀D. 最好用瑞氏染色复染E. 严格掌握网织红细胞的识别标准2. 目前临床采用的自动血沉仪的工作原理和类型包括A. 光电比浊法B. 红外线扫描法C. 动态摄影法D. 低速离心法E. Zeta离心法3. 中性粒细胞退行性变包括A. 胞体肿大B. 核固缩C. 核棘突D. 核溶解E. 结构模糊4. 常见的异常血小板形态有A. 幼稚型B. 老年型C. 病理幼稚型D. 病理刺激型E. 退化型5. 近年来研究的新型试剂盒主要有A. 快速反应试剂盒B. 粉剂试剂盒C. 浓缩试剂盒D. 卡式试剂盒E. 一步法试剂盒6. 试剂盒的准确度性能指标判断通常为A. 回收率B. 线性范围C. 定值血清的靶值范围D. 对照试验E. 干扰试验的结果7. 诊断试验的评价原则包括A. 必须将诊断试验与金标准进行比较研究B. 研究对象应具有代表性C. 有足够的样本含量D. 有合理可靠的临界值E. 介绍研究方法应明确、具体8. HCG检验的临床意义是A. 早期妊娠诊断B. 异常妊娠的诊断C. 流产的诊断和监察D. 滋养层细胞肿瘤的诊断E. 卵巢癌的诊断9. 痰液镜检发现大量嗜酸性粒细胞常见于A. 支气管哮喘B. 过敏性支气管炎C. 心力衰竭D. 嗜酸性粒细胞增多症E. 早期肺结核10. 正常人痰片中查不到A. 红细胞B. 白细胞C. 上皮细胞D. 夏科-莱登结晶E. 胆固醇结晶11. 尿中胆色素检验包括A. 尿胆红素B. 直接胆红素C. 尿胆原D. 尿胆素E. 一分钟胆红素12. 急性粒细胞白血病的血象特点包括A. 白细胞计数一定高于正常B. 白细胞分类中以中、晚幼粒细胞为主C. 全血细胞减少D. 可见较多原始和幼稚阶段粒细胞E. 血小板增多13. β-TG和PF4增高见于A. 血栓前状态B. 血栓性疾病C. 血小板减少症D. VwdE. 血友病14. 血小板在止血中功能包括A. 活化因子Ⅻ，启动内源凝血途径B. 粘附功能C. 聚集功能D. 释放功能E. 收缩功能15. 酶促反应底物种类和浓度的选择应考虑A. 底物的KmB. 底物的特异性C. 溶解度D. 稳定性E. 价格16. 采血时间不宜在空腹多少小时后进行A. 6、8～12、14B. 8～24C. 12～24D. 24以上E. 随时17. 下列哪些作为暂定靶值A. 根据20次或更多独立批次获得的质控测定的结果算出的平均值B. 根据至少20次质控测定的结果算出的平均值C. 以最初20个数据和3-5月在控数据汇集的所有数据的累积平均数D. 以3-5个月在控数据汇集的所有数据的累积平均数E. 根据10次获得的质控测定的结果算出的平均值18. 国际标准化委员会将标准品(参考物)的定义暂定为A. 它的一种或几种物理性质已经充分确定B. 被用于校正仪器或C. 用于评价一种测定方法的物质D. 它的一种或几种化学性质已经充分确定E. 将其分成三级19. 常用的血红蛋白质控物是A. 全血质控物B. 醛化半固体红细胞C. 定值的溶血液D. HiCN参考品E. 氯化血红素20. 影响血沉测定值的血浆因素有A. 红细胞数量B. 纤维蛋白原含量C. 球蛋白含量D. 血红蛋白含量E. 胆固醇含量21. 红细胞直径测量的临床应用包括A. 判断红细胞大小改变B. 观察红细胞形态改变C. 了解血细胞比容分布情况D. 用于进行贫血形态学分类E. 帮助判断贫血类型22. 胎儿肺成熟度检查的试验包括A. 羊水泡沫试验B. 羊水葡萄糖测定C. 羊水磷脂酰甘油测定D. 羊水肌酐E. 羊水吸光度测定23. 在选购试剂盒时应注意的事项为A. 仔细阅读说明书，对试剂盒选用方法有所了解B. 检查有无卫生部的批准文号C. 试剂盒的储存期至少为2年D. 应选购包装合适，近期出厂的产品E. 在确保试剂盒质量前提下，应选购价格低的产品24. 终点法时间反应曲线应符合A. 试剂空白的吸光度是否符合规定标准B. 试剂空白的时间反应曲线应平坦，且无明显波动C. 反应能在读取测定吸光度的时间之前达到平衡D. 反应达到平衡后，吸光度最大并维持不变E. 为上升型曲线25. 提高临床诊断效率的方法有A. 选择高患病率的人群B. 选择低患病率的人群C. 利用平行试验提高诊断敏感性D. 利用系列试验提高诊断的特异性E. 尽可能的使用单项试验诊断疾病26. 黏液稀便多见于下列哪些疾病A. 肠炎B. 痢疾C. 霍乱D. 阿米巴痢疾E. 细菌性痢疾27. 下列属于漏出液变化的是A. 一般不凝固B. 蛋白质含量小于25g/LC. 浆液黏蛋白试验阳性D. 葡萄糖含量小于3.3mmol/LE. 细胞分类以淋巴细胞和间皮细胞为主28. 符合结核性脑膜炎脑脊液检查的特点是A. 脑脊液外观呈毛玻璃样轻度混浊B. 脑脊液中氯化物明显减少C. 脑脊液中氯化物正常D. 脑脊液中早期以中性粒细胞为主E. 脑脊液外观呈脓性混浊29. 脑脊液是血浆通过脉络丛选择性过滤而形成。
酶工程考试复习题及答案
酶工程考试复习题及答案一、名词解释题1.酶活力 : 是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
2.酶的专一性 : 是指一种酶只能对一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物无催化作用的性质，一般又可分为绝对专一性和相对专一性。
3.酶的转换数 :是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数，即是每摩尔酶每分钟催化底物转变为产物的摩尔数，是酶的一个指标。
4.酶的发酵生产 : 是指通过对某些特定微生物进行发酵培养后，利用微生物生长发酵过程中特定的代谢反应生成生产所需要的酶，最后通过提取纯化过程得到酶制剂的过程称为酶的发酵生产。
5.酶的反馈阻遏 :6.细胞破碎 :是指利用机械、物理、化学、酶解等方法，使目标细胞的细胞膜或细胞壁得以破坏，细胞中的目标产物得以选择性或全部释放便于后续收集和分离的过程称为细胞破碎。
7.酶的提取 : 是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提，是酶分离纯化过程常用的手段之一。
8.沉淀分离 : 是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离的方法，常用语酶的初步提取与分离。
9.层析分离 : 亦称色谱分离，是一种利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相 )，另一个相则流过此固定相 (称为流动相 )并使各组分由于与固定相和流动相作用力的不同以不同速度移动，从而达到分离的物理分离方法。
10.凝胶层析 : 又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。
是指以各种多孔凝胶为固定相，在流动相冲洗过程中混合物中所含各种组分的相对分子质量和分子大小不同，在固定相凝胶微孔中移动的距离不同，从而依次从层析柱中分离出来，达到物质分离的一种层析技术。
11.亲和层析 : 是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，将混合物装入层析柱中利用流动相的冲洗作用和目标分子与固定相配基亲和作用力不同而使生物分子分离纯化的技术。
酶偶联测定法
酶偶联测定法一、引言酶偶联测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高灵敏度、高特异性的生物分析技术，广泛应用于医学、生物学、环境监测等领域。
本文将从原理、步骤、优点和应用等方面介绍ELISA的相关知识。
二、原理ELISA的基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合来检测样品中特定的蛋白质分子。
具体而言，ELISA包括以下几个步骤：1. 固定抗原：将含有抗原的溶液加入到微孔板中，使其吸附在孔底上。
2. 阻断非特异性结合：加入一些无关蛋白质（如牛血清蛋白）来防止非特异性结合。
3. 加入待测样品：将待测样品加入到微孔板中与固定抗原结合。
4. 加入检测抗体：加入与待测蛋白质特异性结合的检测抗体，该抗体通常标记有酶（如辣根过氧化物酶HRP）或荧光染料。
5. 加入底物：加入与酶标记结合的底物，使其发生化学反应，产生荧光或颜色变化。
6. 读取结果：利用光度计或荧光计测量颜色或荧光强度，从而确定待测样品中特定蛋白质的浓度。
三、步骤ELISA的步骤可以分为以下几个方面：1. 准备样品和试剂：包括制备抗原、检测抗体和底物等试剂，以及样品的收集和处理。
2. 固定抗原：将含有抗原的溶液加入到微孔板中，并在恰当条件下使其吸附在孔底上。
3. 阻断非特异性结合：加入一些无关蛋白质（如牛血清蛋白）来防止非特异性结合。
4. 加入待测样品：将待测样品加入到微孔板中与固定抗原结合。
5. 加入检测抗体：加入与待测蛋白质特异性结合的检测抗体，该抗体通常标记有酶（如辣根过氧化物酶HRP）或荧光染料。
6. 加入底物：加入与酶标记结合的底物，使其发生化学反应，产生荧光或颜色变化。
7. 读取结果：利用光度计或荧光计测量颜色或荧光强度，从而确定待测样品中特定蛋白质的浓度。
四、优点ELISA具有以下几个优点：1. 高灵敏度：ELISA可以检测非常低浓度的分子，通常可以检测到纳克级别的抗原或抗体。
2. 高特异性：ELISA可以通过特异性结合来检测待测样品中特定的蛋白质分子，避免了其他成分的干扰。
临床生物化学检验技术试题及答案
临床生物化学检验技术试题及答案近年来，临床检验生物化学领域不断发展，取得了显著的进展。
一方面，随着技术的不断进步，生物化学检测方法越来越精确、快速、简单化和自动化。
另一方面，临床检验生物化学的应用范围也越来越广泛，不仅涉及传统的疾病诊断和治疗，还包括个性化医疗、医学预测、药物研发等方面。
未来，临床检验生物化学的发展趋势将主要体现在以下几个方面：1.精准医疗：将个体生物信息、基因组学、转录组学、蛋白质组学等技术与临床检验生物化学相结合，实现更加精准的医学诊疗。
2.自动化和智能化：使用自动化设备和智能化技术，提高检测效率和准确性。
3.多组学联合：将生物化学、基因组学、转录组学、蛋白质组学等多组学技术相结合，建立更加全面的生物信息学数据库，为疾病的预防、诊断及治疗提供更加全面的信息。
4.标准化和规范化：建立统一的标准和规范，保证临床检验生物化学的质量和可靠性，促进临床应用的发展。
14.在进行酶活性浓度测定时，常推荐加入磷酸吡哆醛的酶是ALP。
推荐加入磷酸吡哆醛是因为它可以与酶的磷酸基结合，形成黄色产物，从而测定酶的活性浓度。
15.连续监测法测定ALT所用基质通常是丙氨酸-a酮戊二酸。
连续监测法是一种测定酶活性的方法，通过连续测量反应产物的浓度变化来确定酶的活性。
在测定ALT时，丙氨酸-a酮戊二酸是常用的基质。
16.显示“胆酶分离”前兆的疾病是肝癌。
胆酶分离是指胆汁中的胆酸和胆固醇分离的现象。
在肝癌等疾病中，胆酸和胆固醇的分离现象会出现，因此可以作为“胆酶分离”前兆的疾病。
17.LD催化乳酸生成丙酮酸的反应较适当的pH是7.6.LD是一种催化乳酸生成丙酮酸的酶，它的最适pH为7.6.18.乳酸脱氢酶一般形成的同工酶的种类有5种。
同工酶是指在酶的催化作用下，产生的具有相同分子量但电泳迁移率不同的酶。
乳酸脱氢酶一般形成的同工酶有5种。
19.骨折时血清LD同工酶上升最高的是LD1.在骨折时，血清LD同工酶会上升，其中LD1的上升幅度最高。
酶学分析技术(1)
1
酶活性的单位是指在特定的条 件下，使酶促反应达己规定在某特定
条件下生成一定量的产物为一个单位。 2.国际单位（IU）
在规定的实验条件下，每分钟催 化1µmol底物发生反应的酶量。 3.Katal
酶偶联测定法
EX
Ea
Ei
A
B
C
P
LDH、MDH、G6PD、GLDH作工具酶均是 以NAD（P）H为辅酶的脱氢酶。
P+NAD(P)H+H+ PH2+NAD(P)+
17
将水溶性的酶，通过物理或化学的 方法，使其吸附、包埋或共价结合在 固相载体上，成为不溶于水但仍保留 催化活性的酶的衍生物称为固相酶。 优点：可反复使用
机械强度大 稳定性好 抗干扰性强
18
几种酶的稳定性（天）
名称
室温 4 ℃ -20℃
乳酸脱氢酶
7 7 30
天冬氨酸氨基转移酶 2 14 30
丙氨酸氨基转移酶 2 14 30
肌酸激酶
0.3 0.6 2
碱性磷酸酶
0.5 6 600
淀粉酶
2 60 60
19
同工酶的产生机理
❖ 不同基因位点编码 ❖ 等位基因编码 ❖ 多条肽链化学修饰产生
13
2.连续监测法（又称速率法）
每隔一定时间（10～60秒）连续测定酶 促反应中某一产物或底物变化量称为连续监 测法。 优点 容易找到线性期、结果可靠、省时、 省试剂、省样品 缺点 反应速度易受温度、pH、底物浓度 等因素的影响。
14
工具酶
酶学分析是将酶作为试剂的一种分 析技术，它包括：
生化基础物质检测—酶活性检测
反应进程曲线（速率
时间（s）
法） 317 334 351 368 385 402
吸光度（A） 1.253 1.204 1.178 1.146 1.126 1.097
据此计算此酶的∆A/min
419 1.048
1.450
1.400
1.350
延滞期
1.300
预孵育期
终点法
1.250 1.200
速率法
线性期
指示酶
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P
待测物质 中间产物
终产物
酶偶联反应的原理：
在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有 恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期 可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定
常用指示酶及其指示反应
1.脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱
反应如下：
色原物质
Trinder反应：
POD
2H2O2 + 4-AAP + 酚
醌亚胺（红色） + 2H2O
应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）
等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通 过Trinder反应加以测定
酶偶联法测定ALT的吸光度变化图
吸光度(A）
氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下 列反应：
P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+ 可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定
应用：ALT、AST、CK等酶活性测定
2.过氧化物酶（POD）
酶偶联反应法
酶偶联反应法酶偶联反应法是一种常用的生物化学分析方法，它利用酶的高度特异性催化作用，通过酶标记物与待测物相互作用，从而实现对待测物的检测和定量测定。
在酶偶联反应法中，酶标记物是关键的组成部分。
酶标记物是指将酶与待测物相连的分子，常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
酶标记物通常通过化学方法或基因工程技术获得，具有一定的稳定性和活性。
酶偶联反应法的原理是利用酶的催化作用，将待测物与酶标记物发生特异性的结合反应，形成酶标记物-待测物复合物。
然后，通过适当的底物或试剂，使酶标记物发生催化反应，生成可检测的产物。
这些产物可以通过不同的检测方法，如吸光度、荧光度或放射性测定等进行定量分析。
酶偶联反应法具有许多优点。
首先，酶具有高度特异性，可以选择性地与待测物结合，从而提高检测的灵敏度和准确性。
其次，酶标记物可以通过化学修饰或基因工程技术进行调整，以适应不同的检测需求。
此外，酶偶联反应法操作简便、灵敏度高，适用于多种生物样品的检测，如血清、尿液、组织、细胞等。
酶偶联反应法在许多领域得到了广泛的应用。
在医学诊断中，酶偶联反应法可用于检测病原微生物、肿瘤标志物、药物残留等，对于早期诊断和疾病监测具有重要意义。
在生物学研究中，酶偶联反应法可用于研究蛋白质相互作用、基因表达调控等重要生命过程。
此外，酶偶联反应法还广泛应用于食品安全、环境监测等领域。
尽管酶偶联反应法具有许多优点和应用前景，但也存在一些限制。
首先，酶标记物的选择和制备需要一定的专业知识和技术，这对于一些实验室条件有限的研究者来说可能是一个挑战。
其次，酶偶联反应法在样品处理和准备过程中可能存在一定的误差，影响结果的准确性。
此外，酶偶联反应法对于某些复杂样品的检测可能存在干扰和困难。
酶偶联反应法作为一种常用的生物化学分析方法，在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要的作用。
随着技术的不断发展和改进，酶偶联反应法将进一步提高灵敏度和特异性，拓展其应用领域，并为生物学和医学研究提供更多的实验手段和理论支持。
pepc酶活的测定.
2. 实验试剂：50mM ATP溶液，50mM磷酸肌酸溶液，0.2mM NaHCO3溶液，160U/ml 磷酸肌酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶溶液（U为酶活力单位），25mM RuBP溶液，5mM NADH，Rubisco提取介质（40mM Tris-HCl缓冲液，pH7.6，内含10mM MgCl2溶液，0.25mM EDTA，5mM谷胱甘肽），反应介质（0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.8，内含12mM MgCl2溶液，0.4mM EDTA）。
3实验步骤3.1 酶粗提液的准备取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10,000×g离心10min，弃沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C备用（王维光，1985；张志良等，2003）。
3.3.2 Rubisco酶活力的测定按下表配制反应体系：试剂加入量ml5mM NADH 0.250mM ATP 0.2酶提取液0.150mM磷酸肌酸0.20.2mM NaHCO30.2反应介质1.4160U/ml磷酸肌酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶0.1双蒸水0.3将配制好的反应体系混匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计计上测量340nm处反应体系的OD值，作为零点值。
将0.1mlRuBp加入比色杯内，立即计时，每隔20s测一次OD值，共测3min。
以零点到第1min 的OD值下降的绝对值计算酶活力。
由于酶提取液中可能存在3-磷酸甘油酸（PGA），会使酶活力的测定产生误差，因此除上述测定外还需做一个不加RuBp的对照。
对照的反应体系与上述酶的反应体系完全一样，所不同的仅仅是把酶提取液放在最后加，加入后马上测定此反应体系340nm处的OD值，并记录前1min内OD值的变化量。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
酶学分析方法及酶活性测定复习与练习
酶学分析方法及酶活性测定复习与练习1、酶浓度与酶促反应速度的关系是？2、底物浓度与酶促反应速度的定量关系式是？3、影响酶促反应速度的因素主要有哪些？4、Km及Vm代表的含义及它们在临床酶活性测定中应用及意义。
二、酶活性测定的基本知识1、酶活性的概念及酶活性单位如何表示表示2、目前酶活性单位有-------、----------、-------------三种表示方式。
？3、解释酶活性国际单位、催量（Katal）的概念，并比较两者的关系？4、酶活性单位的计算：几类计算公式要求理解并熟练应用。
1）通用公式2）惯用单位的计算公式（测定产物生成类的计算公式；测定底物消耗类的计算公式）3）某某连续监测法根据摩尔吸光系数进行酶活性浓度的计算；某某连续监测法因素F值（全自动化生化仪多用K表示）的计算和应用？三、酶活性的测定方法1、酶活性测定的基本原则是什么？2、酶反应时间进程曲线有————、—————、————三个时期酶活性测定是在————期测定，此时期反应速度不受------------的影响也称------期3、根据反应时间，酶活性测定分为两类方法是---------和--------------两种从概念、结果计算、优缺点叙述并比较两类方法？其中连续监测法4、按检测对象的酶活性测定方法分为----------和------------法；其直接法的方法类型有哪些？5、何谓酶偶联反应？写出酶偶联反应的基本模式？什么是待测酶、辅助酶、指示酶？6、何谓工具酶？酶作为工具应用于临床生化检验可进行酶活性测定或进行代谢物浓度（底物）的测定时一般有哪两大指示系统？何谓-Trinder反应？Trinder反应的主要缺点或影响因素有哪些？7、何谓同工酶？同工酶分析的常用原理有哪些？检测同工酶有何临床意义？并举例说明？8、酶活性测定条件及影响因素有哪些？9、从几个酶类测定（如AMY、ALT、LD、ALP|等）的实验操作中，讨论酶活性测定应注意的问题？10、试述影响血清酶的生理变异有哪些？11、酶活性测定，标本的采集、处理、贮存及样品试剂比有何要求？四、体液酶测定：1、常用于临床协助诊断的血浆酶有哪些？用于协助诊断心肌损伤、肝脏疾病、胰腺疾病、骨骼骨骼肌、前列腺疾病等的常用的血清酶有哪些？常用的临床诊断酶谱有哪些？2、将各血清酶活性测定的方法学原理进行分析归纳，请总结出有哪几大反应基础。
4.2酶偶联法测定酶活性
(2)间接偶联：当无合适的Ei直接与Ex偶联时，可加
入另一种酶来将Ex与Ei连接起来。
Ex
Ea
Ei
A
B
C
D Ea: a — assistant
Ea— 辅助酶：与指示酶联系，辅助偶联反应进行的酶。
几种临床诊断酶盒的偶联反应
1.肌酸激酶 CK
肌酸磷酸＋ADP
肌酸＋ATP
HK
ATP＋葡萄糖
G-6-P+ ADP
G-6-PDH
G-6-P + NAD+
NADH +H++葡萄糖酸-6-P
内脂
HK：己糖激酶
2.ALT:
ALT
L-丙氨酸＋α-酮戊二酸
L-谷氨酸＋丙酮酸
LDH
丙酮酸＋NADH＋H+
L-乳酸＋NAD +
3.AST
AST
L-天冬氨酸＋α-酮戊二酸
L-谷氨酸＋草酰乙酸
MDH
草酰乙酸＋NADH＋H +
L-苹果酸＋NAD +
使用最频繁的方法
Ex
Ei
S
Px
Pi
指示酶(Ei):常用脱氢类,如:LDH
酶偶联的连续监测法的偶 联方式：
(1)直接偶联：待测酶(Ex)+指示酶(Ei)
Ex
Ei
A
BLeabharlann C Ei: i — indicator
特点：①A、B无法直接测； ②需用Ei来催化→C，C可监测,(Ei— 指示酶) 指示酶定义：能提供直接监测的产物，起指示 偶联反应作用的酶(常为脱氢酶)
MDH：苹果酸脱氢酶
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第四章 酶学测定技术 酶偶联法测定酶活性 彭剑雄 中南大学湘雅医学院医学检验系
酶活性测定的主要影响因素及控制要点
和 K 可用校准物定期校正。
3.2 校准物
可用作酶活性测定用的校准物分两类。 一类是产物的基准物质，
如对硝基酚、对硝基苯胺等， 用于校准仪器的 值（摩尔吸光系数）。
另一类称酶校准物（Enzyme calibrator），
指样品先与缺乏某种底物的试剂1预孵育一定时 间后，再加入内这种底物的试剂2，开始启动样 品中的待测酶的酶促反应。
好处是在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某 些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。
这种模式需要双试剂剂型。
样品启动模式。
指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品， 依靠样品中的待测酶来启动酶促反应；
酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类，以后者 为主。
酶催化化学反应的能力称为酶活性（activity）。 酶活性浓度的测定受许多因素的影响。
酶活性浓度测定的主要影响因 素
1. 标本及标本采集和处理因素 2. 试剂及方法学因素 3. 仪器因素的影响 4. 测定条件与参数设置
1.标本及标本采集和处理因素 的影响及控制
常见的影响因素
2.1 定时法与连续监测法 2.2 检测底物或检测产物 2.3 底物启动模式与样品启动模式 2.4 正向反应与逆向反应 2.5 试剂的干扰作用
2. 影响因素的控制
选购试剂盒时
要仔细阅读试剂盒说明书； 了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等； 选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方
检测系统
光度计的准确性、重复性、线性范围和杂散光等 均会造成结果的偏差。
3 仪器影响因素的控制
在日常工作中，除常规做好仪器和设备的 正确使用和维护外，
酶活力测定方法
NH
NH-CO-
H2N-C-NHCH2CH2CH2-CH-COOC2H5
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12 次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0. 4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品 37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进 样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起, 所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系 统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分 析。
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
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使用最频繁的方法
Ex
Ei
S
Px
Pi
指示酶(Ei):常用脱氢类,如:LDH
酶偶联的连续监测法的偶 联方式：
(1)直接偶联：待测酶(Ex)+指示酶(Ei)
Exi — indicator
特点：①A、B无法直接测； ②需用Ei来催化→C，C可监测,(Ei— 指示酶) 指示酶定义：能提供直接监测的产物，起指示 偶联反应作用的酶(常为脱氢酶)
(2)间接偶联：当无合适的Ei直接与Ex偶联时，可加
入另一种酶来将Ex与Ei连接起来。
Ex
Ea
Ei
A
B
C
D Ea: a — assistant
Ea— 辅助酶：与指示酶联系，辅助偶联反应进行的酶。
几种临床诊断酶盒的偶联反应
1.肌酸激酶 CK
肌酸磷酸＋ADP
肌酸＋ATP
HK
ATP＋葡萄糖
G-6-P+ ADP
第四章 酶学测定技术 酶偶联法测定酶活性 彭剑雄 中南大学湘雅医学院医学检验系
间接连续监测法：
目前，大部分酶都无法直接测定，因为需S与P间理化 特性有显著差异，方可直接连续监测
(1)经典间接法：要求：显色剂对酶活性无影响 E
S → P + 显色剂 → 呈色产物 连续检测
(2)酶偶联方法：如：与指示酶偶联： 已成为应用最广，
G-6-PDH
G-6-P + NAD+
NADH +H++葡萄糖酸-6-P
内脂
HK：己糖激酶
2.ALT:
ALT
L-丙氨酸＋α-酮戊二酸
L-谷氨酸＋丙酮酸
LDH
丙酮酸＋NADH＋H+
L-乳酸＋NAD +
3.AST
AST
L-天冬氨酸＋α-酮戊二酸
L-谷氨酸＋草酰乙酸
MDH
草酰乙酸＋NADH＋H +
L-苹果酸＋NAD +
MDH：苹果酸脱氢酶
谢 谢！