原核表达

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pET System and Host Cell
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实验目的 实验原理 实验步骤 数据记录 结果及分析
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实验目的
理解诱导表达蛋白质的原理，培养 细菌，诱导表达蛋白质。 掌握Ni-柱亲和纯化蛋白质的原理和 方法，SDS-PAGE检测纯度。
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实验原理
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亲和层析
Affinity chromatography
SDS-PAGE试剂：
Running buffer: buffer Staining Solution: Destaining Solution： Solution： 10×1 liter 1 liter 2 liters
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实验步骤
1. MDM蛋白的诱导表达
⑴ 接菌：将大肠杆菌接种于含50µg/ml Kan+ 的10 ml LB液 体培养基中，置于恒温摇床中37℃振荡培养过夜。 ⑵ 转接：次日，按1:100转接，即吸取5 ml过夜培养物加入 500 ml 含50µg/ml Kan+ LB培养基中，37℃振荡培养至 OD600值0.6-0.8(about 3hr)。吸取150µl菌液，标记为诱导 诱导 前菌液。 ⑶ 诱导：加100μl、0.1 mM IPTG，22℃(或室温，200rmp) 振荡培养6-8 hr。吸取150µl菌液，标记为诱导后 诱导后菌液。 ⑷ 集菌：将培养物50ml离心管，平衡后，5000 rpm，4℃离 心10min，弃上清液。各加入15 ml裂解缓冲液，用移液枪 使菌体悬起，5000 rpm，4℃离心10min，弃上清液。菌 体放置于-20℃长期保存，或直接进行超声波破碎。
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实验步骤
6．蛋白质SDS-PAGE电泳鉴定
电泳槽安装 制胶
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一、电泳的基本原理
电泳： 带电颗粒在电场的作用下发生
定向迁移的过程。
利用电泳技术分离蛋白质：
利用电场的作用下，待分离样品中各 种分子带电性质以及分子本身大小、 形状等性质的差异，使带电分子产生 不同的迁移速度，从而对样品进行分 离、鉴定或提纯的技术。
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实验步骤
3. 亲和层析柱的制备
⑴ 如果使用新的填料装柱
① 用Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia) 填料制备0.5~1 ml的亲和层析柱 ② 用10倍柱体积(medium volumes)的蒸馏水洗亲 和柱 ③ 用5-10倍柱体积100 mM硫酸镍洗亲和柱, 至穿 柱液流出颜色为绿色 ④ 用10倍柱体积的蒸馏水洗亲和柱
10μl 10μl 10μl 10μl
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五：实验结果
比较诱导前后细菌总蛋白电泳图谱， 分析纯化原理和纯化结果。
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2007年学生实验结果
ne La Marker 1
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3
4
5

6
7
8
9
10
97kDa 66kDa 43kDa 30kDa 20kDa 14.4kDa
Marker S7 10μl 8μl
蛋白质化学实验技术
棉花动蛋白（kinesin） GhKCH2马达区重组蛋白的 原核表达及Ni柱亲和层析纯化
CAU.WUWEI
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实验背景
马达蛋白 原核表达载体
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1
马达蛋白
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蛋白质表达系统
原核表达具有操作方便、快捷，需时 较短，表达量大，适合工业化生产等 优点。 pET系统(Novagen) ：克隆及原核表 达系统
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2
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pET System and Host Cell
Target genes are cloned in pET plasmids under control of strong bacteriophage T7 transcription and (optionally) translation signals; Expression is induced by providing a source of T7 RNA polymerase in the host cell.
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试剂配制
1 M MgCl2 1 M咪唑 (pH7.5)
[配出500 mM咪唑]
100ml 300ml 300ml 300ml 500ml
0.05 M EDTA, 0.5 M NaCl溶 100 mM 硫酸镍 0.2M 磷酸缓冲液，pH6.9
(即：55ml 0.2M Na2HPO3+ 45ml 0.2M NaH2PO3) 即：55ml 45ml
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试剂配制
裂解缓冲液： 500ml
0.05M 磷酸缓冲液 pH 6.9, 1mM MgCl2
清洗缓冲液： 300ml
0.05M 磷酸缓冲液pH 6.9, 1mM MgCl2，100mM 咪唑 磷酸缓冲液pH
洗脱缓冲液： 300ml
0.05M 磷酸缓冲液pH 6.9，1mM MgCl2，300mM 咪唑 磷酸缓冲液pH 6.9，
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实验步骤
3. 亲和层析柱的制备
⑵ 如果是使用过的填料装柱
① 用0.05 M EDTA, 0.5 M NaCl溶液洗亲和柱5-6 倍柱体积（10ml） ② 用5-10倍柱体积的蒸馏水洗亲和柱(10ml) ③ 用5-10倍柱体积100 mM硫酸镍洗亲和柱, 至穿 柱液流出颜色为绿色(10ml) ④ 用10倍柱体积的蒸馏水洗亲和柱(10ml)
适用的凝胶浓度(%)
20–30 15～20 10～15 5～15 2～5
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一、电泳的基本原理
SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理
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分离胶：胶浓度12％，12ml
分离胶缓冲液 Acr/Bis H2O 25％过硫酸铵 TEMED 3 ml 4.8 ml 4.2 ml 30 μl 10 μl
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聚丙烯酰胺凝胶的形成
丙烯酰胺： [CH2=CHCONH2] =CH 甲叉双丙烯酰胺：[CH2(NHCOHC=CH2) 2 ] 乙烯基“CH2=CH－” 成丙烯酰胺长链， 甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链 间形成甲叉键交联，形成交联的三维网状 结构。
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分 子 量 范 围
蛋白质： <104 1～4×104 4×104～1×105 1～5×105 75×105
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)：
以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。
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聚丙烯酰胺凝胶的形成
由单体的丙烯酰胺(Acrylamide) 和甲叉双丙 烯 酰 胺 (N,N’-methylenebisacrylamide) 聚 合 而成。 聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催 化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。 化学聚合通常是加入引发剂过硫酸铵(AP)以 及催化剂四甲基乙二胺(TEMED)。
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实验步骤
4．亲和层析纯化
⑴ 裂解缓冲液洗5-10倍柱体积 ⑵ 缓慢上样，将穿柱液(留20µl，记为FT1)再上样 一次,收集穿柱液，吸取20µl(记为FT2)制样。 ⑶ 裂解缓冲液洗5-10倍柱体积 ⑷ 清洗缓冲液洗5-10倍柱体积 ⑸ 洗脱缓冲液洗5 ml，每个离心管收集500µl，共 十管，记为样品1，样品2 ······样品10(S1, S2, S3,…S10)，各取15 µl制样。
S6 8 μl
S5 8μl
S4 8μl
S3 2μl
S2 2μl
S1
沉淀
上清液 10μl
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20 μl 10μl
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2007年学生实验结果
Marker 10μl
穿柱 液 20μl
S1
S2
S3
S4
S5 10μl
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10μl 10μl 10μl 10μl
Questions
IPTG的使用量与表达蛋白质的关系 低温、低转速培养的目的 超声波破碎细胞后，比较上清液和沉淀中目的 蛋白质的量，若沉淀中很多，说明什么？怎么 解决？
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实验步骤
2. 超声波破碎细胞 ⑴ 菌体加15 ml裂解缓冲液悬起，加入300 µl 0.1M PMSF ⑵ 超声破碎20 sec，间隔30sec，共超声1520次。 ⑶ 12000 rpm，4 ℃离心30 min，取上清。吸 取100 µl制样记为上清。 ⑷ 沉淀加10 ml裂解缓冲液，重悬起。吸取 100µl制样记为沉淀。
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pET System and Host Cell
T7 RNA polymerase is so selective and active that, when fully induced, almost all of the cell’s resources are converted to target gene expression; the desired product can comprise more than 50% of the total cell protein a few hours after induction. Target protein expression may be initiated by transferring the plasmid into an expression host containing a chromosomal copy of the T7 RNA polymerase gene under lacUV5 control. Expression is induced by the addition of IPTG or lactose to the bacterial culture