综述 溶菌酶的制备及其性质

综述溶菌酶的制备及其性质

Abstract：Lysozyme is a kind of glucoside hydrolytic enzyme，and its molecular weight is about 14000—15000Da．Lysozyme can hydrolyze the glucoside bond β -1，4 between N-acetyl muramic acid，so that it can dissolve the cell wail of gram-positive bacteria and bacteriolyze．It can be applied in many areas，for example，in food and drink fields as antiseptic substance and in medical domain as germicide.

【实验要求】：

通过探索和学习相关内容的理论和技术，熟悉并进一步掌握酶的提取，分离，纯化，检测溶菌酶的生物学性质和理化性质。

【实验原理】 :

溶菌酶：是一种有效的抗菌剂，又称胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

来源：自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的鼻涕、唾液、眼泪、尿、血浆、乳汁、淋巴液及鼻黏膜、肠道、腮腺、白细胞、肺、肝、脾、肾的细胞中，以及植物界中的卷心菜、萝卜、无花果、术瓜、大麦中，但以蛋清中含量最丰富。

理化性质：分子量14700；溶于水，不溶于乙醚和丙酮，等电点为10.8，最适pH值6.5。最适温度50℃；稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；280nm的消光系数为13.0。酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。

提取原料：鸡蛋（含量约为2%到4%）。鸡蛋清按水分和固形物所占比重，则含水分87%，固形物13%；固形物中大约90%是蛋白质，其中：卵白蛋白75%，卵类粘蛋白15%，卵粘蛋白7%，伴白蛋白3%。卵白蛋白分子量45000，pl4.7；卵类粘蛋白鸡卵粘蛋白分子量28000，pl3.9-4.5；伴白蛋白分子量77000，pl3.9。

实验方法：

a．热变性法：溶菌酶在酸性条件下耐热性好，耐热89°C以上，100°C加热仍然保持活性，而杂蛋白卵蛋白等变性温度低。可用热变性法来去除杂蛋白。

b．等电点沉淀法：蛋清中其他蛋白等电点较低，为3到5左右（见上一步蛋清成分分析），溶菌酶pl为10.8，可用调pH来去除卵蛋白，来提高溶菌酶浓度。

c．D152树脂柱层析法：离子交换树脂法提纯溶菌酶是根据溶菌酶和离子交换树脂的基团之间进行交换的，由于溶菌酶是一种碱性蛋白质，可采用阳离子交换树脂。

离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律。树脂对离子亲合

力的大小，与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关。经实验证明，在

低浓度、常温下，离子交换树脂对不同离子的亲合力顺序有下列规律。对于在

弱酸性阳离子交换树脂中具有相同价态离子的亲合力顺序为：Ag+＞Cs+＞Rb+

＞K+＞NH4+＞Na+＞H+>Li+。根据弱酸性阳离子交换树脂的亲和力顺序，相同条

件下弱酸性阳离子交换树脂对H+的亲和力比对Na+的亲和力要大，可采用D152，D201，D903型大孔树脂进行交换。蛋白质中溶菌酶含量一定，由于树脂对H+

的亲和力比对Na+的亲和力要大，而使得溶菌酶与Na型树脂交换得更彻底，故

本实验采用Na型树脂。

d．Sephadex- G-50分子筛柱层析：葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而

在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全

被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间

流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的

网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。Sephadex-G-50为

每克凝胶膨胀时吸水5.0克，SephadexG-50 葡聚糖凝胶 G-50 分离范围

1500-30000 适用于多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定。

e．SDS-PAGE：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素，通过迁移率不同经过跑柱和染色后可以得到不

同蛋白质的分离带，来鉴定蛋白质的种类。本实验用来验证只有一条带（溶菌

酶），来鉴定纯度（可能只有溶菌酶）。

f．Folin-酚试剂法测定蛋白质含量：此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白

质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中

的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白

质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在

一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。

g．微球菌和溶菌酶作用测定酶活力：由于溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm

波长下吸光度下降的速度来表示酶活性。

h.超滤法提纯蛋清溶菌酶：超滤法是利用膜两侧的压力差，使小分子透过膜，而大