管碟法测定抗生素效价详解

管碟法的操作步骤
预试验→试验准备→ 双碟底层的制备→
供试品、标准品溶液的制备→菌层的制备
→滴加抗生素溶液→双碟的培养→ 抑菌圈
的测量→结果的可靠性检验及效价测定
• 预试验：
确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、 使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所 致的抑菌圈直径在18～22mm。高剂量与 低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的 抑菌圈差别较小时，可用4wenku.baidu.com1的剂量比率）。
仪器与用具 1 . 操作室 2. 双碟 3. 陶瓦盖 4. 钢管 5. 钢管放置器 6. 恒温培养箱 7. 灭菌刻度吸管 8. 玻璃容器 9. 称量瓶 10.毛细滴管或可调式移液器（1～1000μ l) 11.天平 12.抑菌圈(直径)测量仪。 13.超净工作台 用于菌种的接种或传代。超净工作台须置 洁净工作室或半无菌室内。
抗生素微生物测定法
一、概述
1.抗生素的概念及抗生素的生物检定
抗生素是由微生物所产生的极微量便 具有选择性地杀死或抑制其他病原微生物 生长的一类天然有机化合物。 抗生素的生物检定是以抗生素对微生 物的抗菌效力作为效价的衡量标准。
2.抗生素的效价和单位
抗生素的含量用效价和单位表示。该 词有时不加区别统称为效价单位。 效价（ｐ otency ），指检品的实际 单位数与其标示量的比值。常表示为效价 的百分数。 单位（ unit,u ）单位是衡量抗生素有 效成分的具体尺度。
（１）重量单位 以抗生素的生物活性部分重量作 单位 １微克（ｕｇ）＝１单位，１毫克＝１０００单位。 （２）类似重量单位 以特定的纯粹抗生素盐类的 重量作为１单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四环素 盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）１微克 （ｕｇ）＝１单位，１毫克＝１０００个单位。 这是根据国际使用习惯而来的。 （３）质量折算单位 以特定的纯抗生素盐的质量 为单位而加以折算。青霉素0.6ug为1单位 （４）特定单位 以特定的抗生素标准品的某一质 量定为一单位。
2.原理－抑菌圈的形成
• 两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养 基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌 的生长作用。 • 当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种 互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中 便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因 抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受 到抑制，此处琼脂培养基成透明状；在抑 菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低 抑菌浓度。
一、试验前准备
• 双碟的挑选
内径约90mm，硬质玻璃或 塑料培养平皿，水平透明， 无色斑气泡
• 物品的清洗、灭菌
培养皿、钢管、刻度吸管清 洗后160℃干热灭菌2小时或 121℃高压蒸汽灭菌30min， 放置室温备用；陶瓷瓦盖要 定期清洗干燥。
牛津杯的挑选
内径（6.0±0.1）mm，高 （10.0±0.1）mm，外径 （7.8±0.1）mm，重量差异不超 过±0.01g，光洁平坦
氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过。
基本要点 ： ① 高剂量抗生素溶液所形成的抑 菌圈直径在18～22mm； ② 高、低剂量所形成的 抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差数可 较小； ③ 高、低剂量之比一般用2:1，当高、 低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量 之比为4:1的比率。
• 试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭 菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、 缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
• 供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价，根据试验要求设计供 试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供 试品、标准品相关剂量的溶液。
1. 称量 称量前，将标准品从冰箱取出，使与温室平衡； 供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品 应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前1～2 ｈ更换 天平内干燥剂。标准品与供试品的称量最好一次取样称取， 不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内，标准品称量 不可少于 20mg，取样后立即将称量瓶及被称物盖好，以免吸 水。样品的称样量最好不少于50mg。
抗生素微生物检定法
• 管碟法
• 浊度法
1 、管碟法：是利用抗生素在摊布特定试验 菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含有 一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁 殖而呈现出的透明抑菌圈。此法系根据抗生 素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈面 积呈线性关系，通过比较
标准品与供试品产生抑菌
圈的大小，计算出供试品
• 磷酸盐缓冲液（pH6.0） 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢 钾8g，加水使成1000ml，滤过。 • 磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钠 （Na2HPO4*12H2O）9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使
缓冲液的制备
成1000ml，滤过。
• 磷酸盐缓冲液（pH7.8） 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二
的效价。
• 2、浊度法系利用抗生素在液体培养基中对 试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后 细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品 对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品 效价的一种方法。
管碟法测定抗生素效价 原理和方法
一、 原理 在一定的抗生素浓 度范围内，对数剂量 ( 浓 度 ) 与抑菌圈的表面积或 直径成正比，可以得出 一条曲线。 抗生素浓度换算成对 数，则抑菌圈直径与抗 生素对数成直线关系
检定菌的来源：检定菌种由中监所所提 供的冷冻干燥品。 检定菌的传代和接种： 芽胞杆菌3～6个月（其他细菌每个月） 用普通琼脂斜面传代1次，将新传代的培养物 代替原有的菌种，作为工作用（阳性对照）菌 种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要 求进行。
冷冻菌种安瓶的接种。
•
用75%酒精棉擦净菌种安瓿的外壁， 稍干。 点燃酒精灯，将安瓿的封口，一端 在火焰上烧灼红热用毛细管吸取灭菌水少许 在灼热处，使其骤冷而炸裂，另取1支灭菌 毛细滴管，在火焰旁吸取少量灭菌水，加至 菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随 即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面， 将营养琼脂斜面琼脂斜面于37℃恒温培养24 小时。