第七章 植物单倍体培养

水稻花药培养
愈伤组织转接种到再生培养基
愈伤组织分化形成再生植株
水稻花药培养过程：
旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍 左手持穗，右手 用镊子取花药， 放无菌培养皿中 剥去旗叶鞘，取出稻穗
无菌水洗3次
10％漂白粉10 min
用接种环接种 到培养基上
培养5天，花药变褐，20天后花药裂 开，长出淡黄色的花粉愈伤组织， 先长芽，后长根，形成幼苗。
基本培养基：
MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养； B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养； N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养。

激素种类和浓度
细胞分裂素可促进胚状体形成； 生长素可诱导愈伤组织形成。 细胞分裂素与生长素比值高时可诱 导愈伤组织分化苗
蔗糖浓度
较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织； 较低 浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。
鉴定花药和花粉植株染色体倍性的方法：
1、染色体直接计数法
细胞学鉴定，通常取根尖、茎尖等分生组织区
进行制片，直接计数染色体数目。
2、间接鉴定
（1）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，
花小柱头长，花粉粒小，不结实。 （2）细胞形态学鉴定 叶片保卫细胞大小、单位面积上 的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具 有高度的相关性。 （3）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定 叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的
花药培养：其外植体为 植物雄性生殖器官的一部 分，就培养方法和技术来 讲，属于器官培养的范畴。 花粉培养：将处于一定 发育阶段的花粉从花药中 分离，再加以离体培养。 有时花粉培养也称为小孢 子培养(microspore culture)。从培养方法和 技术方面来讲，它属于细 胞培养的范畴。
第七章 植物单倍体(花药)培养
四、离体小孢子发育的影响因素



植株基因型：裸子植物难，被子植物简单 大白菜：早熟简单，晚熟难。 培养基成分：MS.其次B5.N6培养基。 植物生长条件和生理状态：幼年、开花初期。 小孢子发育状态：单核期（多）。 预处理：低温处理 培养条件：一般温度25℃，光照无或正常光照 等
（1）、基因型
需震荡，以利通气。 养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，
凝固后，在表面加入少量液体培养基。


4、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释 放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻 片形成微室进行花粉培养
4、影响因素
光照 pH 蔗糖浓度
温度
湿度 培养基 成分 激素
选幼年树花蕾
花粉培养流程
消毒
预培养数天
取花药
取花蕾（镜检） 培养
接种
分离花粉
愈伤组织发生
1.烟草花药培养---胚状体发育途径
烟草花药培养
部分花药通过胚状体途径形成小植株
2.芸苔小孢子培养----胚状体发育途径
芸苔属小孢子培养
a) 球形胚
d)
鱼雷形胚
芸薹：油菜花
Late stage embryos (21 days) (B. napus)
培养花药数 15 77 21 63 30
胚状体（%） 0 7.8 19.4 1.59 0
一些植物花药和花粉培养适宜的小孢子发育时期
适宜小孢子发育时期 减数分裂期 四分孢子期 单核早期 单核晚期 单核早期至晚期 单核早期至双核期 四分孢子期至双核期
代表植物 番茄、草莓 葡萄 油菜、苹果、石刁柏 小麦、茄子、青椒、荔枝、楸子 烟草、柑橘、橡胶、龙眼、杨树 水稻、甘蓝、梨 玉米
草莓花药愈伤组织,再生植株,花药植株
本章小结：
(1)花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养。 (2)花药培养一般选择花粉的单核期进行接种。 (3)花药培养包括：选择材料-消毒-接种培养-愈合组织 生成-分化出单倍体植株。 (4)花粉的发育途径包括：营养细胞发育、生殖细胞发 育、营养和生殖细胞同时发育及花粉均等分裂发育。 (5)花粉培养包括花粉的分离-预处理-培养过程。 (6)花粉植株形态发生方式：愈伤组织发生途径，胚胎 发生途径。 (7)常见植物单倍体培养技术：烟草、芸薹、草莓、水 稻.



A 生殖核发育途径：生殖核继续分裂，形成多 细胞的花粉，进一步发育形成愈伤组织或胚状 体。 B 营养核发育途径：营养核继续分裂，形成多 细胞的花粉，进一步发育形成愈伤组织或胚状 体。 C 营养核与生殖核并发发育途径：营养核和生 殖核分别继续分裂，形成多细胞的花粉，进一 步发育形成愈伤组织或胚状体。
（3）、生理状态的选择
1.幼年的花药好于老年的花药 2.开花初期花药好于开花末期花 药 3.不同季节接种的花药愈伤组织 诱导率有显著变化。
百合的成熟花粉
（4）、小孢子发育状态
大多数植物，在单核时期的花粉 比较容易培养成功。 确定花粉发育时期的方法可用 涂片法来进行。
采用醋酸洋红染色， 压片镜检，确定花 粉的发育时期
低温（3℃ ）处理对四季橘花药愈伤组织和胚状体形成的影 响
处理 天数 接种 花药（枚） 发生愈伤组织的 花药 枚 5 8 9 18 5 3 % 0.59 1.11 1.00 2.13 1.06 0.69 发生胚状体的花数 枚 8 12 15 5 2 3 % 0.94 1.66 1.66 0.59 0.43 0.69
（5）、预处理
◆花药和花粉的预处理措施主要是低温处理 ◆耐寒植物比喜温植物处理的温度可低些 ◆较低温度处理时间要短，较高温度处理时间宜 长 小麦：15℃,2-7天
水稻：510℃,3-12天
不同资料有 所不同！
低温处理的作用机理：
A、低温可改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体 的轴向，形成两个均等细胞，使得花粉朝着 胚胎方向发育； B、低温使花粉保持较长时间的活力，使营养 细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。
使用量可少到1cm2。
第二节 花药和花粉培养的应用 ----单倍体植株育种
1、诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种 周期； 2、有利于筛选隐性突变体，提高选择效率; 3、有利于隐性基因控制性状的选择 4、快速获得自交系的超雄株
大大缩短育种周期
花粉培养过程：
1）预处理:低温冷藏是最常用的方法 2）表面消毒 3）接种 4）培养形成花粉植株。 花粉---愈伤组织---苗 花粉---胚状体---苗
5、花粉植株形态发生方式

胚胎发生途径：小孢子发育与合子发育相似， 经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚等阶 段，但没有胚柄。 愈伤组织发生途径：产生愈伤组织，分化出胚 状体或不定芽。

六、单倍体植株的鉴定
花药和花粉培养的主要目的是制备单倍体 植株。 但其再生植株并不都是单倍体。 因此，必须对获得的花药和花粉植株进行 倍性鉴定。
饱和漂白粉溶液中浸泡10—20min，或 在0.1%升汞溶液中处理10min左右;
◆
无菌水漂洗3—5次.
同常规组织 培养
2、获得花粉的方法
A、机械挤压梯度离心法
◆花药消毒 ◆用镊子或小玻璃杵子将花粉从花药中挤压出
◆用30%蔗糖离心收集悬浮上层的完整花粉粒
◆用培养基洗涤几次
◆培养
无菌条件下
B、自然散粉法
第一节 花药和花粉培养技术
一、花药培养是将花粉发育至一定阶段的花药接 种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或 愈伤组织进而分化成植株的技术。
1964年，印度学 者采用花药培养 方法，首次获得 毛叶曼陀罗单倍 体植株
发生核 融合
药物处 理
第一节 花药和花粉培养技术

二、花粉培养：是将花粉从花药中分离 出来进行离体培养的过程。
花粉囊 花粉囊壁 花药裂口 成熟花粉粒 油菜成熟花药的结构
三、离体单倍体发生途径



1、对称发育途径：均等分裂，形成两个相同的 核。 A. 两个细胞再次分裂，一个停止，一个持续分 裂，形成愈伤组织。 B.两个细胞分裂中，形成核融合，产生多倍体。
2、不对称发育途径：不均等分裂。形成营养和 生殖核
◆消毒后的花药接种在液体培养基中 ◆一定温度下振荡培养 ◆花粉自行散落到培养基中 ◆除去花药壁 ◆花粉重新培养在新鲜培养基上
无菌条件下
3、培养基及培养方法的选择
最常用的培养基是MS培养基。 培养方法： 平板培养 液体培养 双层培养 看护培养 微室培养
1、平板培养 2、液体培养 3、双层培养
花粉置琼脂固化培养基上培养。 花粉悬浮在液体培养基中培养， 花粉置固体-液体双层培养基上培
电镜下的花粉粒
小孢子发育状态
花粉粒即雄配子体。为2细胞花粉或3细胞花粉
2--细胞花粉 3--细胞花粉
花粉发育时期：
适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)
营养细胞 生殖细胞 精子
雄配子体的发育
A、花粉发育时期
四分体
小孢子
单核花粉
双核花粉
最适期
B、花药和花粉培养的取材时期
四分体 单核早期 单核晚期 双核早期 双核晚期 三核期
对照 5 10 15 20 25
848 723 902 846 470 434
处理天数不同， 效果明显wenku.baidu.com同
五、外植体制备及接种
材料：未开放的花蕾 原因：花药和花粉处于无菌状态 灭菌：表面灭菌杀灭花蕾表面微生物 处理强度以轻为好
1、花药和花粉培养的表面灭菌
◆ ◆
70%—75%酒精浸润花蕾30s左右;
3.水稻花药培养----愈伤组织发育途径
水稻花药培养
接种在平板上的水稻花药
部分花药产生愈伤组织
花粉发育时期的检测：
外部形态观察：在水稻中，一般叶枕距为5-15cm， 颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2时， 可能为单核靠边期的花粉。
压片染色法：是检测花粉发育时期的简便有效方法， 常用染色剂为醋酸洋红。
以花药培养获得单倍体植株的植物： 茄科 十字花科
禾本科
百合科
不同苹果品种的花药培养胚状体的诱导率 接种花药 数 978 1410 1073 1302 产生胚状 体数 21 10 7 7 诱导率 （%） 2.1 0.7 0.6 0.5
品种 元帅 赤阳 国光 金冠
（2）、培养基
蔗糖浓度
基本培养 基
激素种类 和浓度
花的结构
雄 花药 芯 花丝 柱头 雌 花柱 芯 子房 花瓣 花 花萼 冠 花托
花柄
第七章 植物单倍体(花药)培养
名词
单倍体植物(haplobiont) 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完 整的植株。 花粉和花药的培养(pollen and anther culture) 是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能， 不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成 完整单倍体植株的技术。
植物组织培养
第七章 植物单倍体(花药)培养
大 家 好 ！
第七章 植物单倍体(花药)培养
第七章 植物单倍体(花药)培养(2学时)
本章主要内容： 花粉和花药培养技术 花粉和花药培养应用
第七章 植物单倍体(花药)培养
本章教学目的与要求
(1)掌握花药培养和花粉培养的区别； (2)了解花药最佳接种时期； (3)掌握花药培养的大致过程； (4)掌握花粉发育的四种途径； (5)掌握花粉培养的大致过程。
4、草莓花药培养脱 毒
1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； 花药采取时期
单核期：花蕾4-6mm，花药1mm 花药诱导愈伤组织培养基 MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L 增殖分化培养基 MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L 生根培养基 1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L
小孢子 花粉培养
花粉粒 花药培养
不同植物 有区别
Sunderland（1971）对烟草不同花粉发育 时期的培养反应进行了观察：
花粉发育时期 减数分裂期 单核时期 单核晚期 双核时期
胚状体诱导率（%） 0 14 44 55
烟草小孢子发育时期对胚状体诱导率的影响
小孢子发育时期 单核早期 单核靠边（中） 单核靠边（晚） 双核早 双核晚